一种基于凝血酶发色底物法检测达比加群含量的试剂盒制造技术

本申请提供一种基于凝血酶发色底物法检测达比加群含量的试剂盒，包括凝血酶、凝血酶发色底物、含有达比加群的人血浆标准品和稀释液；凝血酶的工作浓度为0.1～2U/ml；凝血酶发色底物法的工作浓度为0.05～1mmol/L。检测机理是凝血酶加入样本血浆，凝血酶裂解其发色底物，得到吸光度信号。而血浆中的达比加群会抑制凝血酶，所以在一定的范围之内，达比加群的含量和吸光度信号呈负相关。所述试剂盒基于凝血酶发色底物法法实现监测血浆中达比加群含量变化。所述试剂盒实现快速准确检测达比加群含量，达比加群在0～500ng/ml范围内，R≥0.99，线性关系较好，所述试剂盒相对偏差小于1％，准确性高。

A kit based on thrombin chromogenic substrate assay for detection of dabigatran

The present invention provides a kit for detecting Darby thrombin chromogenic substrate method based on additive group content, including thrombin, thrombin chromogenic substrate, containing dabigatran in human plasma and standard dilution; concentration of thrombin was 0.1 ~ 2U/ml; the concentration of thrombin chromogenic substrate method was 0.05 ~ 1mmol/L. The mechanism of thrombin detection is that thrombin is added to the sample plasma, and thrombin is used to split the chromogenic substrate to obtain absorbance signal. The dabigatran in plasma inhibited thrombin, so the content of dabigatran was negatively correlated with absorbance in a certain range. The kit was used to monitor the change of dabigatran content in plasma based on thrombin chromogenic substrate method. The kit to achieve rapid and accurate detection of dabigatran levels of dabigatran in the range of 0 ~ 500ng/ml, R = 0.99, a good linear relationship, the kit relative deviation is less than 1%, the accuracy is high.

【技术实现步骤摘要】
一种基于凝血酶发色底物法检测达比加群含量的试剂盒
本专利技术属于医学检验
，具体涉及一种基于凝血酶发色底物法检测达比加群含量的试剂盒。
技术介绍
达比加群酯(dabigatranetexilate)是一种新型口服抗凝药，通过直接抑制凝血酶(凝血因子FIIa)发挥抗凝作用，可用于预防髓关节/膝关节置换术后静脉血栓栓塞形成，或预防心房颤动导致脑卒中等。虽然抗凝作用的药物有很多，例如华法林，但是达比加群酯具有明显的优势：起效快、抗凝疗效可预期等，但是如同所有抗凝剂，达比加群酯会导致出血事件。目前还未开发出针对达比加群酯的特异性拮抗剂。而临床上服用达比加群酯的患者一旦出现大出血，或者需要手术后者侵入性处理，一般会采取紧急逆转抗凝活性的措施来应对。该方法不仅不利于提前预防出血症状，还会给患者带来生理和心理的双重伤害，因此，严重影响了患者的健康和恢复。虽然达比加群酯较华法林和依诺肝素相比具有较高的安全性，但是该药在被医院和患者使用时，随着使用人数的增加，人们发现对达比加群血液浓度的监测和调整剂量是必要的，对其密切监测可使严重出血风险大幅度降低,从而提高用药的安全性。活化部分凝血活酶时间(aPTT)是测定內源性凝血系统的筛选试验,也可以作为内源性途径凝血因子的定量试验。此法可以用来检测达比加群的血液含量；其原理为将待测血浆加入部分凝血活酶溶液，在钙离子参与下纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白，测定凝固所需的时间，即为待测血浆活化部分凝血活酶时间；使用了达比加群的血浆活化部分凝血活酶时间会延长，此法可用来监测达比加群的血液含量。活化部分凝血活酶时间(aPTT)是测定內源性凝血系统的筛选试验，也可以作为内源性途径凝血因子的定量试验；凝血时间，即从加入部分凝血活酶溶液到血浆凝固的时间是整个实验的基础，因此凝血时间必须精确，否则实验结果难以准确，在待测血浆加入部分凝血活酶溶液，激活了整条内源性凝血途径，导致血浆凝固。整条内源性凝血途径所牵涉的凝血因子众多，所以此法受到的干扰因素较多，达比加群的血液浓度和活化部分凝血活酶时间的相关系数不强，难以进行精确的量化。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供迅速准确，可以实现自动化测量的达比加群含量的试剂盒。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种基于凝血酶发色底物法检测达比加群含量的试剂盒，包括凝血酶、凝血酶发色底物、含有达比加群的人血浆标准品和稀释液；凝血酶的工作浓度为0.1～2U/ml；凝血酶发色底物的工作浓度为0.05～1mmol/L。优选的，所述凝血酶的工作浓度为0.2～1U/ml。优选的，所述凝血酶发色底物的工作浓度为0.1～0.5mmol/L。优选的，所述凝血酶发色底物为H-D-CHG-Ala-Arg-pNA·2AcOH、Tos-Gly-Pro-Arg-pNA·AcOH、H-D-CHG-But-Arg-pNA·2AcOH、H-D-CHG-Pro-Arg-pNA·2AcOH、H-D-CHA-Ala-Arg-pNA·2AcOH、H-D-CHA-Gly-Arg-pNA·2AcOH、CH3OCO-Gly-Pro-Arg-pNA·AcOH、H-β-Ala-Gly-Arg-pNA·2AcOH、H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl、pyroGlu-Pro-Arg-pNA·HCl或H-D-Ala-Pro-Arg-pNA·2HCl。优选的，所述稀释液的组分包括缓冲液、无机盐、稳定剂、表面活性剂和防腐剂。优选的，所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液或磷酸缓冲液；所述缓冲液的pH值为7.2～7.8。优选的，所述无机盐为氯化钠或氯化钾；所述无机盐的质量浓度优选为0.15～0.25mol/L；优选的，所述表面活性剂为聚乙二醇-8000或吐温-20；所述表面活性剂的质量浓度为0.05％～0.15％。优选的，所述稳定剂为小牛血清或酪蛋白；所述稳定剂的质量浓度为0.08％～0.15％；优选的，所述防腐剂为Proclin300或叠氮钠；所述防腐剂的质量浓度优选为0.1～1mg/ml。本申请提供了一种基于凝血酶发色底物法检测达比加群含量的试剂盒，包括凝血酶、凝血酶发色底物、含有达比加群的人血浆标准品和稀释液；凝血酶的工作浓度为0.1～2U/ml；凝血酶发色底物的工作浓度为0.05～1mmol/L。所述试剂盒的检测机理是凝血酶加入样本血浆后会作用于发色底物，通过裂解其发色底物产生信号。而血浆中的达比加群会抑制凝血酶，达比加群含量越高,对凝血酶的抑制越强,得到的吸光度信号越弱。所以在一定的范围之内,达比加群的含量和吸光度的信号是负相关关系,可以根据标准曲线达到定量检测的目的。本专利技术所述试剂盒基于凝血酶发色底物法实现监测血浆中达比加群含量变化，所述试剂盒实现快速准确检测达比加群含量，研究发现，达比加群浓度在0～500ng/ml时，R≥0.99，线性关系较好，同时所述试剂盒相对偏差小于1％，准确性较好。同时，本专利技术提供的试剂盒经过多次测量时，CV值小于2％，重复性较好。所述试剂盒可以检测到低至15ng/ml的达比加群。附图说明图1为实施例3中绘制的标准曲线图。具体实施方式本专利技术提供了一种基于凝血酶发色底物法检测达比加群含量的试剂盒，包括凝血酶、凝血酶发色底物、含有达比加群的人血浆标准品和稀释液；凝血酶的工作浓度为0.1～2U/ml；凝血酶发色底物的工作浓度为0.05～1mmol/L。本专利技术提供了一种基于凝血酶发色底物法检测达比加群含量的试剂盒，研究发现，达比加群浓度在0～500ng/ml时，R≥0.99，线性关系较好，同时所述试剂盒相对偏差小于1％，准确性较好。本专利技术提供的一种基于凝血酶发色底物法检测达比加群含量的试剂盒包括凝血酶。所述凝血酶的工作浓度为0.1～2U/ml，优选为0.2～1U/ml，更优选为0.5U/ml。所述凝血酶的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的凝血酶即可。本专利技术中，所述凝血酶购自西格马(Sigma)。本专利技术提供的一种基于凝血酶发色底物法检测达比加群含量的试剂盒包括凝血酶发色底物。所述凝血酶发色底物的工作浓度为0.05～1mmol/L，优选为0.1～0.5mmol/L，更优选为0.3mmol/L。所述凝血酶发色底物为H-D-CHG-Ala-Arg-pNA·2AcOH、Tos-Gly-Pro-Arg-pNA·AcOH、H-D-CHG-But-Arg-pNA·2AcOH、H-D-CHG-Pro-Arg-pNA·2AcOH、H-D-CHA-Ala-Arg-pNA·2AcOH、H-D-CHA-Gly-Arg-pNA·2AcOH、CH3OCO-Gly-Pro-Arg-pNA·AcOH、H-β-Ala-Gly-Arg-pNA·2AcOH、H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl、pyroGlu-Pro-Arg-pNA·HCl和H-D-Ala-Pro-Arg-pNA·2HCl中的一种或几种。所述凝血酶发色底物的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的凝血酶发色底物即可。本专利技术提供的一种基于凝血酶发色底物法检测达比加群含量的试剂盒包括稀释液。所述稀释液的作用是对凝血酶和凝血酶发色底物进行稀释，得到凝血酶和凝血酶发色底物溶液。本专利技术中，所述稀本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于凝血酶发色底物法检测达比加群含量的试剂盒，包括凝血酶、凝血酶发色底物、含有达比加群的人血浆标准品和稀释液；凝血酶的工作浓度为0.1～2U/ml；凝血酶发色底物的工作浓度为0.05～1mmol/L。

【技术特征摘要】
1.一种基于凝血酶发色底物法检测达比加群含量的试剂盒，包括凝血酶、凝血酶发色底物、含有达比加群的人血浆标准品和稀释液；凝血酶的工作浓度为0.1～2U/ml；凝血酶发色底物的工作浓度为0.05～1mmol/L。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述凝血酶的工作浓度为0.2～1U/ml。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述凝血酶发色底物的工作浓度为0.1～0.5mmol/L。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述凝血酶发色底物为H-D-CHG-Ala-Arg-pNA·2AcOH、Tos-Gly-Pro-Arg-pNA·AcOH、H-D-CHG-But-Arg-pNA·2AcOH、H-D-CHG-Pro-Arg-pNA·2AcOH、H-D-CHA-Ala-Arg-pNA·2AcOH、H-D-CHA-Gly-Arg-pNA·2AcOH、CH3OCO-Gly-Pro-Arg-pNA·AcOH、H-β-Ala-Gly-Arg-pNA·2AcOH、H-D-Phe...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵铁铭，
申请(专利权)人：上海贞元诊断用品科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31