一种检测弓形虫抗体的重组蛋白组合物及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物学检测技术领域，具体提供了一种检测弓形虫抗体的重组蛋白组合物，重组蛋白组合物由SAG1特异表位的重组蛋白和MIC2特异表位的重组蛋白组成。本发明专利技术还提供了重组蛋白的制备方法。本发明专利技术中重组蛋白组合物具有高特异性和高灵敏度，将其用于检测弓形虫抗体，可大大提高检出率，同时避免假阳性和漏检问题。

Recombinant protein composition for detecting antibody of Toxoplasma gondii and preparation method thereof

The invention belongs to the technical field of biological detection, the recombinant protein composition for detection of antibodies to Toxoplasma gondii specific, recombinant protein composition consists of recombinant protein SAG1 specific epitope recombinant protein and MIC2 specific epitope. The invention also provides the preparation method of the recombinant protein. The recombinant protein composition has high specificity and high sensitivity, and can be used for the detection of Toxoplasma gondii antibody, which can greatly improve the detection rate, and avoid false positive and missed detection problems.

【技术实现步骤摘要】
一种检测弓形虫抗体的重组蛋白组合物及其制备方法
本专利技术涉及基因工程技术和诊断试剂领域，具体涉及一种用于检测风弓形虫抗体的重组蛋白组合物及其制备方法。
技术介绍
SAG1和微线体蛋白MIC2被认为在弓形虫侵染宿主过程中发挥了重要作用，在免疫方面SAG1和MIC2被认为是一种理想的诊断抗原，能够准确快速，灵敏的检测出弓形虫的感染，从而被广泛而深入研究。SAG1是目前研究最多和研究最深入的一种膜蛋白，在不同虫株中具有高度保守性，SAG1可以在原核表达系统，真核表达系统和昆虫表达系统进行表达，可以作为诊断抗原进行早期诊断。MIC2是弓形虫入侵宿主细胞过程中必需存在的一个入侵因子，在弓形虫连接到宿主细胞的过程中发挥重要作用。MIC2基因是保守序列，不能被敲除，缺失后会削弱虫体对宿主细胞的入侵能力。虽然目前现有技术中有用于检测弓形虫抗体的重组蛋白，但是仍存在假阳性及漏检问题，针对上述存在的问题，根据SAG1和微线体蛋白MIC2的性质，可以开发一种SAG1和微线体蛋白MIC2特异性表位的重组蛋白的复配组合物，用于检测弓形虫抗体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于是：针对现有技术存在的不足，提供一种特异性强，灵敏度高，可提高检出率，降低漏检的检测弓形虫抗体的重组蛋白组合物。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案是：一种检测弓形虫抗体的重组蛋白组合物，所述重组蛋白由SAG1特异表位的重组蛋白和MIC2特异表位的重组蛋白组成。作为一种改进的技术方案，所述SAG1特异表位的重组蛋白和MIC2特异表位的重组蛋白在所述重组蛋白组合物中按照相同浓度、相同比例混合。作为一种改进的技术方案，所述SAG1特异表位为SAG1蛋白N端第48个氨基酸至316个氨基酸，所述MIC2特异表位为MIC2蛋白N端第75个氨基酸至468个氨基酸。本专利技术的另一个目的在于是：针对现有技术存在的不足，提供一种检测弓形虫抗体的重组蛋白组合物的制备方法。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案是：一种检测弓形虫抗体的重组蛋白组合物的制备方法，所述制备方法包括下列步骤：(1)弓形虫抗体诊断抗原表位的筛选利用在线分析工具，分析弓形虫SAG1和MIC2的氨基酸序列全长，筛选出弓形虫SAG1蛋白特异性抗原位于第48个氨基酸到第316个氨基酸；弓形虫MIC2蛋白特异性抗原位于第75个氨基酸到第468个氨基酸；(2)弓形虫SAG1和MIC2蛋白抗原表位的基因克隆以弓形虫DNA为模板，用SAG1上、下游引物扩增弓形虫SAG1蛋白抗原表位的基因片段；用MIC2上、下游引物扩增弓形虫MIC2蛋白抗原表位的基因片段；电泳胶回收目的片段，-20℃冻存备用；(3)分别构建SAG1和MIC2蛋白表达载体提取pGEX-4T-1和pGEX-4T-2质粒，将pGEX-4T-1和pGEX-4T-2分别双酶切，电泳后胶回收双酶切的质粒片段；弓形虫SAG1蛋白和MIC2蛋白分别双酶切，电泳后胶回收双酶切目的片段；将双酶切质粒和双酶切目的片段按1:3-10比例，用T4连接酶16℃过夜连接，得到重组质粒。作为一种改进的技术方案，所述制备方法还包括下列步骤：重组质粒的筛选和鉴定：将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),涂布含氨苄青霉素的LB平板上，37℃恒温培养箱过夜；次日随机挑取转化菌落和对照菌落，分别提取质粒，进行双酶切，跑电泳，均能看见相应的目的片段和载体片段，构建表达载体成功，即为阳性表达菌；蛋白工程菌高效表达：将鉴定阳性表达菌和对照菌接种至含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃恒温摇床振荡过夜，次日按1:100接种，37℃恒温摇床振荡4h，加终浓度为0.5-1mmol/lIPTG，37℃继续诱导2-6h；离心，收集沉淀菌体，再将沉淀菌体破碎，收集的上清和沉淀分别进行SDS-PAGE检测；发现pGEX-4T-1/SAG1和pGEX-4T-2/MIC2表达的目的蛋白均在上清中，即分别获得了高表达的SAG1和MIC2抗原性片段蛋白的工程菌；表达蛋白的纯化：将高效表达的重组蛋白工程菌离心，收集沉淀菌体，再将沉淀菌体重悬于原离心体积的1/10裂解液内，冰浴超声菌体，离心，收集菌液上清；取上清与50％谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合均匀，离心，弃上清，收集沉淀并向沉淀中加入8-12倍标准体积的PBS混合均匀，离心，再弃上清，收集沉淀并向沉淀中加入1-3倍体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，混匀，离心，收集的上清在PBS中透析24-48h，离心取上清，即分别获得SAG1和MIC2抗原性目的蛋白，-20℃备用。作为一种改进的技术方案，步骤(2)的扩增条件：阶段I:94℃3min；阶段II:94℃30s、58℃30s、72℃1min，30个循环；阶段III:72℃5min。作为一种改进的技术方案，步骤(2)中SAG1和MIC2的上、下游引物分别具有如下所示的序列：SAG1上游引物序列为：5’-AAGAATTCTCGGATCCCCCTCTTG-3’SAG1下游引物序列为：5’-ATCTCGAGACTGGCTGTTCCCGCA-3’MIC2上游引物序列为：5’-ATCCCGGGCTGGACATTTGCTTTCTTAT-3’MIC2下游引物序列为：5’-AACTCGAGTGGACACGGTGAGGTATT-3’。作为一种改进的技术方案，步骤(3)中的重组质粒为pGEX-4T-1/SAG1和pGEX-4T-2/MIC2。本专利技术采用以上技术方案，与现有技术相比，具有以下优点：本专利技术选择SAG1和MIC2两个代表性的抗原蛋白，分析两种蛋白氨基酸序列，挑选抗原性比较强的部分片断，作为重组蛋白的对象，大大提高了表达的产量和特异性，将两种重组蛋白复配得到的重组蛋白组合物具有较好的特异性和敏感性，将其用于诊断弓形虫抗体，大大提高了临床检出率，有效解决了检测时所存在的假阳性及漏检问题。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1一种检测弓形虫抗体的重组蛋白组合物，由SAG1特异表位的重组蛋白和MIC2特异表位的重组蛋白按照相同浓度、相同比例混合组成的重组蛋白。其中SAG1特异表位为SAG1蛋白N端第48个氨基酸至316个氨基酸，MIC2特异表位为MIC2蛋白N端第75个氨基酸至468个氨基酸。实施例2一种诊断弓形虫抗体重组抗原组合物的制备方法，包括以下步骤：(1)弓形虫抗体诊断抗原表位的筛选利用ExPasy、TMHMM、SignalIP4.1等在线分析工具，分析弓形虫SAG1和MIC2的氨基酸序列全长，筛选出弓形虫SAG1蛋白特异性抗原位于第48个氨基酸到第316个氨基酸；弓形虫MIC2蛋白特异性抗原位于第75个氨基酸到第468个氨基酸；(2)弓形虫SAG1和MIC2蛋白抗原表位的基因克隆SAG1抗原表位DNA序列两侧设计引物上游引物5-AAGAATTCTCGGATCCCCCTCTTG-3’EcoRI酶切位点下游引物5’-ATCTCGAGACTGGCTGTTCCCGCA-3’XhoI酶切位点MIC2抗原表位DNA序列两侧设计引物上游引物5’-ATCCCGGGCTGGACATTTGCTTTCTTAT-3’SmaI酶切位点下游引物5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测弓形虫抗体的重组蛋白组合物，其特征在于：所述重组蛋白组合物由SAG1特异表位的重组蛋白和MIC2特异表位的重组蛋白组成。

【技术特征摘要】
1.一种检测弓形虫抗体的重组蛋白组合物，其特征在于：所述重组蛋白组合物由SAG1特异表位的重组蛋白和MIC2特异表位的重组蛋白组成。2.根据权利要求1所述的一种检测弓形虫抗体的重组蛋白组合物，其特征在于：所述SAG1特异表位的重组蛋白和MIC2特异表位的重组蛋白在所述重组蛋白组合物中按照相同浓度、相同比例混合。3.根据权利要求1所述的一种检测弓形虫抗体的重组蛋白组合物，其特征在于：所述SAG1特异表位为SAG1蛋白N端第48个氨基酸至316个氨基酸，所述MIC2特异表位为MIC2蛋白N端第75个氨基酸至468个氨基酸。4.一种检测弓形虫抗体的重组蛋白组合物的制备方法，其特征在于所述制备方法包括下列步骤：(1)弓形虫抗体诊断抗原表位的筛选利用在线分析工具，分析弓形虫SAG1和MIC2的氨基酸序列全长，筛选出弓形虫SAG1蛋白特异性抗原位于第48个氨基酸到第316个氨基酸；弓形虫MIC2蛋白特异性抗原位于第75个氨基酸到第468个氨基酸；(2)弓形虫SAG1和MIC2蛋白抗原表位的基因克隆以弓形虫DNA为模板，用SAG1上、下游引物扩增弓形虫SAG1蛋白抗原表位的基因片段；用MIC2上、下游引物扩增弓形虫MIC2蛋白抗原表位的基因片段；电泳胶回收目的片段，-20℃冻存备用；(3)分别构建SAG1和MIC2蛋白表达载体提取pGEX-4T-1和pGEX-4T-2质粒，将pGEX-4T-1和pGEX-4T-2分别双酶切，电泳后胶回收双酶切的质粒片段；弓形虫SAG1蛋白和MIC2蛋白分别双酶切，电泳后胶回收双酶切目的片段；将双酶切质粒和双酶切目的片段按1:3-10比例，用T4连接酶16℃过夜连接，得到重组质粒。5.根据权利要求4所述的一种检测弓形虫抗体的重组蛋白组合物的制备方法，其特征在于所述制备方法包括下列步骤：重组质粒的筛选和鉴定：将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),涂布含氨苄青霉素的LB平板上，37℃恒温培养箱过夜；次日随机挑取转化菌落和对照菌落，分别提取质粒，进行双酶切，跑电泳，均能看见相应的目的片段和载体片段，构建表达载体成功，即为阳性表达菌；蛋白工...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨致亭，刘泽军，丁兆明，徐冬梅，张守永，王婷，
申请(专利权)人：潍坊汉唐生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37