马铃薯M病毒鉴定用的引物、试剂盒及鉴定方法技术

本发明专利技术公开了马铃薯M病毒RT‑LAMP鉴定用的引物、试剂盒及鉴定方法,引物，包括：PVM‑F3:5’‑TTCAGGCCGTGCTGTTCT‑3’；PVM‑B3:5’‑CAGCATGTGGTTCCAAGTCA‑3’；PVM‑FIP:5’‑GCACCCCTAGGCCACTCAAA‑GGATGCAAGCAGCTCAGT‑3’；PVM‑BIP:5’‑GGACGCTGTGCTTGCTGTGA‑CAGGCGCATACAACCTACA‑3’。本发明专利技术的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种快速、简便、高效、准确性高、特异性强、灵敏性高，马铃薯M病毒RT‑LAMP鉴定用的引物方法、试剂盒及鉴定方法。

Primer, reagent kit and identification method for identification of potato M virus

The invention discloses a potato virus M RT LAMP identified by primer, kit and identification method, primers, including: PVM F3:5 TTCAGGCCGTGCTGTTCT '3' PVM B3:5 '; CAGCATGTGGTTCCAAGTCA 3; PVM' FIP:5 GCACCCCTAGGCCACTCAAA GGATGCAAGCAGCTCAGT '3' PVM BIP:5 '; GGACGCTGTGCTTGCTGTGA CAGGCGCATACAACCTACA 3'. The purpose of the invention is to overcome the defects in the prior art, and provides a fast, simple and efficient, high accuracy, strong specificity, high sensitivity, primer method, potato virus M RT LAMP identified by the kit and identification method.

【技术实现步骤摘要】
马铃薯M病毒鉴定用的引物、试剂盒及鉴定方法
本专利技术涉及一种马铃薯M病毒RT-LAMP鉴定用的引物、试剂盒及检测方法，属于生物

技术介绍
马铃薯M病毒potatovirusM,PVM发现于美国、法国、英国、德国、荷兰等国家,目前,PVM在世界各地均有发生[1]。PVM是香石竹潜隐病毒属Carlavirus成员。病毒粒体大小为650nmX12nm,有一个未完全封闭的病毒衣壳。致死温度为65-71℃,体外保毒期为5-7d,稀释限点为102-103。在寄主植物的任何部位都可检测到病毒,病毒主要存在于细胞质中。发现在感病植物细胞的细胞质中可出现呈无定形的X体状的内含体。该病毒基因组为单链正义RNA,长8535bp,其3'端有个Poly(A),5'端可能有一个甲基化的帽子结构,基因组RNA含有6个ORFs,编码6个蛋白。PVM的RNA的ORFI编码223kDa的复制酶；ORF2、ORF3和ORF4分别编码一个25kDa、12kDa和7kDa蛋自,组成了一个三基因盒,参与病毒的胞间运动；ORF5编码34kDa外壳蛋白；重叠的ORF6编码11-16kDa富含半胱氨酸的蛋白,该产物的功能还不清楚,但从结合核酸的能力看,可能有助于蚜虫传播或者涉及寄主基因转录及病毒RNA的复制[1]。PVM的自然寄主主要是茄科植物，包括马铃薯、番茄及人参果等，在实验室中也可侵染觅色黎、昆诺黎、毛曼陀罗、千日红、菜豆、番茄、豇豆等。该病毒可通过机械传播、嫁接传播也可通过节肢动物如蚜虫的非持久性方式传播,但不能通过种子和花粉传播。侵染寄主后引起的典型症状为小叶皱缩扭曲斑驳和矮化。专利
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种快速、简便、高效、准确性高、特异性强、灵敏性高，马铃薯M病毒RT-LAMP鉴定用的引物；本专利技术另一个目的是提供一种包含上述引物的用于鉴定马铃薯M病毒的试剂盒；本专利技术另一个目的是提供一种采用上述马铃薯M病毒RT-LAMP鉴定方法。为了达到上述目的，本专利技术采用以下方案：一种马铃薯M病毒RT-LAMP鉴定用的引物，其特征在于包括：PVM-F3:5’-TTCAGGCCGTGCTGTTCT-3’PVM-B3:5’-CAGCATGTGGTTCCAAGTCA-3’PVM-FIP:5’-GCACCCCTAGGCCACTCAAA-GGATGCAAGCAGCTCAGT-3’PVM-BIP:5’-GGACGCTGTGCTTGCTGTGA-CAGGCGCATACAACCTACA-3’。一种马铃薯M病毒RT-LAMP鉴定用的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有：如上所述的试剂盒，其特征在于所述的2×反应液缓冲液由以下组分组成：如上所述的试剂盒，其特征在于所述的酶溶液为BstDNA聚合酶和AMV逆转录酶混合液。如上所述的任一种试剂盒，其特征在于荧光目视检测试剂中含有钙黄绿素荧光染料。6、一种马铃薯M病毒鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：A、植物组织总DNA提取；B、LAMP检测：采用权利要求2所述的试剂盒配置预反应溶液，在预反应溶液中分别加入待检测的样品的DNA5μL，使总量达到25μL；其中对照组在预反应溶液加入去离子水5μL；阳性对照在预反应溶液中加入带病毒的DNA5μL；用移液器吸排液法混合，或者合上盖子轻击使溶液充分混合后瞬时离心，混合时避免产生气泡；将混合物置于反应孔中，于65℃恒温反应90min，最后80℃下保温5min以结束反应；C、LAMP结果判断扩增反应结束后，使用紫外线照射装置，波长240-260nm，350-370nm，从反应试管底部向上进行紫外线照射，佩戴眼镜等防护用具后从反应试管侧面进行观察，若与阳性对照一样发出绿色荧光，则判定为阳性即样品中带有马铃薯M病毒；若与阴性对照一样未发出绿色荧光，则判定样品中没有携带马铃薯M病毒。如上所述的鉴定方法，其特征在于步骤A中植物组织总DNA提取的具体步骤：a制样：取0.5g的带毒组织加入1mL抽提缓冲液进行研磨；b清洗纳米磁珠：取出免疫纳米磁珠到PCR管中，用ddH2O反复清洗纳米磁珠3次，在磁铁的作用下吸去ddH2O；c结合：加入100μL的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下吸附；d清洗：在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次；e裂解：加入50μLddH2O到PCR管中,用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95℃，10min；f取样：用磁铁吸附纳米磁珠，待PCR管内溶液澄清后，上清即为病毒RNA；g核酸浓度的测定取5μLDNA溶液加ddH2O梯度稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的光密度值；RNA的浓度按照以下公式计算获得：RNAC＝40×N×A式中：C——RNA浓度(ng/μL)A——260nm处的吸光值N——核酸稀释倍数1OD260nm＝40μg/mL单链RNA当OD260/OD280比值在1.7～1.9之间时，适宜于PCR扩增和LAMP检测。如上所述的鉴定方法，其特征在于所述纳米磁珠通过以下方法制备：1)Fe3O4磁性纳米粒子制备与氨基化修饰分别取5.2gFeCl3·6H2O、2.7gFeSO4·7H2O、0.85mL12.1moL/L的浓盐酸溶解于200mL水中，超声脱氧，后将以上溶液滴入250mL、0.75moL/LNaOH溶液；所有反应在80℃下搅拌，随着反应的进行，反应液中出现黑色的沉淀，反应结束后，利用磁分离器将所得沉淀从反应介质中分离出来，再用去离子水清洗3次，无水乙醇清洗2次，并配成5g/mL的Fe3O4磁性纳米粒子无水乙醇溶液，取25mLFe3O4磁性纳米粒子无水乙醇溶液，再用无水乙醇稀释到150mL，超声振荡30min，滴加0.4mLAPTES，其中硅烷偶联剂：3-氨基丙基三乙氧基硅烷，室温下搅拌7h，反应完毕，用磁分离器将APTES修饰的Fe3O4磁性纳米粒子从反应介质中分离，并用无水乙醇溶液清洗3次，最后配成10.5mg/mL的氨基化Fe3O4纳米磁珠无水乙醇溶液；2)免疫磁珠的制备取0.5mL氨基化Fe3O4纳米磁珠无水乙醇溶液，用1mLPBS清洗3次，磁分离器弃上清液，加入5％(V/V)戊二醛溶液2mL，室温振荡交联2h，磁分离，弃上清液，用PBS洗涤3次并弃上清液后，分别采用0.5mL不同稀释倍数的相应病毒抗体包被氨基化Fe3O4纳米粒子，室温下振荡固定2h，磁分离，用PBS和超纯水分别洗涤3次，再用PBS定容，4℃冰箱保存备用，到具有最佳吸附量的一病毒抗体免疫磁珠。本专利技术中所用到的材料：1.1毒株PVM购买于美国AGDIA公司。1.2主要试剂和耗材(1)PCR反应试剂：10×PCRbμffer、dNTPs、MgCl2、TaqDNA聚合酶以及反转录酶(ReverseTranscriptaseM-MLV)均购自宝生物工程(大连)有限公司；(2)DNAMarkerDL1000、6×loadingbμffer，宝生物工程(大连)有限公司；(3)RNA扩增反应试剂盒LoopampRNAAmplificationkit,朗荧光目视检测试剂盒,SYBRGreenI，μorescenceDetectionReagent,朗反应试管均购自于北京蓝谱生物科技有限公司，(4)Bs本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种马铃薯M病毒鉴定用的引物，其特征在于包括：PVM‑F3:5’‑TTCAGGCCGTGCTGTTCT‑3’PVM‑B3:5’‑CAGCATGTGGTTCCAAGTCA‑3’PVM‑FIP:5’‑GCACCCCTAGGCCACTCAAA‑GGATGCAAGCAGCTCAGT‑3’PVM‑BIP:5’‑GGACGCTGTGCTTGCTGTGA‑CAGGCGCATACAACCTACA‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种马铃薯M病毒鉴定用的引物，其特征在于包括：PVM-F3:5’-TTCAGGCCGTGCTGTTCT-3’PVM-B3:5’-CAGCATGTGGTTCCAAGTCA-3’PVM-FIP:5’-GCACCCCTAGGCCACTCAAA-GGATGCAAGCAGCTCAGT-3’PVM-BIP:5’-GGACGCTGTGCTTGCTGTGA-CAGGCGCATACAACCTACA-3’。2.一种马铃薯M病毒鉴定用的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有：3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的2×反应液缓冲液由以下组分组成：4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的酶溶液为BstDNA聚合酶和AMV逆转录酶混合液。5.根据权利要求2至4所述的任一种试剂盒，其特征在于荧光目视检测试剂中含有钙黄绿素荧光染料。6.一种马铃薯M病毒鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：A、植物组织总DNA提取；B、LAMP检测：采用权利要求2所述的试剂盒配置预反应溶液，在预反应溶液中分别加入待检测的样品的DNA5μL，使总量达到25μL；其中对照组在预反应溶液加入去离子水5μL；阳性对照在预反应溶液中加入带病毒的DNA5μL；用移液器吸排液法混合，或者合上盖子轻击使溶液充分混合后瞬时离心，混合时避免产生气泡；将混合物置于反应孔中，于65℃恒温反应90min，最后80℃下保温5min以结束反应；C、LAMP结果判断扩增反应结束后，使用紫外线照射装置，波长240-260nm，350-370nm，从反应试管底部向上进行紫外线照射，佩戴眼镜等防护用具后从反应试管侧面进行观察，若与阳性对照一样发出绿色荧光，则判定为阳性即样品中带有马铃薯M病毒；若与阴性对照一样未发出绿色荧光，则判定样品中没有携带马铃薯M病毒。7.根据权利要求6所述的鉴定方法，其特征在于步骤A中植物组织总DNA提取的具体步骤：a制样：取0.5g的带毒组织加入1mL抽提缓冲液进行研磨；b清洗纳米磁珠：取出免疫纳米磁珠到PCR管中，用ddH2O反复清洗纳米磁珠3次，在磁铁的作用下吸去ddH2O；c结合：加入100μL的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室温下吸附；d清洗：在磁铁的作用下移去上...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘洪义，陈定虎，陈文聪，刘运，张静，苏斐，
申请(专利权)人：陈定虎，
类型：发明
国别省市：广东,44