一种登革病毒的PCR检测方法技术

本发明专利技术涉及蚊虫感染登革病毒的极早期检测方法，该方法包括针对4种登革病毒毒株保守的5’‑UTR序列及基于保守序列的5’‑UTR SL primer的设计，以此特异性5’‑UTR SL primer的逆转录PCR；逆转录PCR扩增条件的设立优化；基于上述引物的实时荧光定量PCR引物的设计和方法建立。本发明专利技术的检测方法工艺简单高效、切实可行；设计的逆转录PCR引物、实时荧光定量PCR引物以及扩增条件具有高特异性、高灵敏度，可以在蚊虫感染登革病毒及越冬蚊虫虫卵、孑孓时期进行极早期检测，提供人群感染登革病毒危险性评估和极早期预警。

PCR detection method for dengue virus

The present invention relates to a mosquito infected by dengue virus very early detection method, the method including the 4 dengue virus strains conserved UTR sequence and 5 'design based on the conserved sequence of the 5' UTR SL primer, the specificity of 5 \UTR SL primer RT PCR; set up optimization reverse transcription PCR amplification conditions; the establishment of the design and method of real-time fluorescence quantitative PCR primers the primers based on the. Process of detecting method of the invention is simple and efficient and feasible design; reverse transcription PCR primers, real-time PCR primers and amplification conditions with high specificity, high sensitivity, can be in mosquitoes infected with dengue virus and mosquito eggs and larvae overwintering period of very early detection of dengue virus infection, to provide risk assessment and early warning.

【技术实现步骤摘要】
一种登革病毒的PCR检测方法
本专利技术属于基因检测
具体地，本专利技术涉及一种蚊虫感染登革病毒的极早期检测方法。
技术介绍
登革热(denguefever，DF)是由伊蚊(Aedes)传播的、登革病毒(denguevirus,DENV)感染引起的人类最严重的虫媒传染病，可引起登革热(DV)、重症登革热和登革休克综合征等。尤其是以高热、严重出血、休克等为临床症状的重症登革热，病死率较高。登革病毒自1943年首次被分离以来，已在100多个国家出现过病毒流行，全球将近一半的人口(约25亿)有罹患登革热的危险，世界卫生组织最新统计数据显示每年约5千万～1亿会发生显性感染，近3亿人会发生隐性感染，显性感染者中约50万人因重症登革热需住院治疗，其中很大一部分是儿童，某些地区的死亡率约5％。由于全球气候变暖、人口快速增长、人员流动性激增等因素，登革病毒感染的威胁正日趋严重，近几十年全球登革热发病率大幅度增长。据预测，全球50-60％的人口可能会面临威胁，登革病毒感染已成为一个世界性的严重公共卫生问题，是世界卫生组织呼吁全球预警和应对(GlobalAlertandResponse，GAR)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种登革病毒的PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、登革病毒RNA的提取纯化：匀浆破碎蚊虫虫体和/或孑孓虫体和/或虫卵，提取全部RNA分子，采取负向选择的方法去除宿主mRNA，纯化得到登革病毒RNA；S2、登革病毒RNA分子的逆转录：根据登革病毒不同毒株之间的共有序列，设计特异性逆转录PCR的茎环状引物，逆转录所述登革病毒RNA得到登革病毒的cDNA；S3、实时荧光PCR：根据所述共有序列和所述茎环状引物，设计实时荧光定量PCR引物，利用实时荧光PCR的方法定量检测登革病毒的浓度。

【技术特征摘要】
1.一种登革病毒的PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、登革病毒RNA的提取纯化：匀浆破碎蚊虫虫体和/或孑孓虫体和/或虫卵，提取全部RNA分子，采取负向选择的方法去除宿主mRNA，纯化得到登革病毒RNA；S2、登革病毒RNA分子的逆转录：根据登革病毒不同毒株之间的共有序列，设计特异性逆转录PCR的茎环状引物，逆转录所述登革病毒RNA得到登革病毒的cDNA；S3、实时荧光PCR：根据所述共有序列和所述茎环状引物，设计实时荧光定量PCR引物，利用实时荧光PCR的方法定量检测登革病毒的浓度。2.根据权利要求1所述的登革病毒的PCR检测方法，其特征在于，所述步骤S1中，基于蚊虫mRNA具有3’-polyA、而登革病毒RNA的3’末端没有多聚polyA的特征，利用寡dT纤维素-核酸纯化柱吸附除去宿主mRNA分子，保留没有3’-polyA的RNA，利用负向选择纯化登革病毒RNA。3.根据权利要求1所述的登革...

【专利技术属性】
技术研发人员：李凌云，王晓红，苏庆宁，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：广东,44