一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法及其应用与试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法及其应用与试剂盒，其涉及生物技术领域。本发明专利技术用于确定在接受器官移植的病人体内是否产生了导致慢性器官排斥的抗体，试剂盒用于检测具有致病性的特异性抗供者抗体。本发明专利技术是将器官受者的血清加入与供者组织相容抗原相同的血管内皮细胞培养物内，在摄氏温度35℃‑37℃下培育后测定血管内皮细胞的反应。试验结果揭示了器官移植受者与供者之间高度特异且精准的相互作用，为早期发现器官排异反应并制定早期治疗方案提供了病理学依据。不需活检材料，为临床医师提供了一种定期监视接受器官移植病人的有力、有效且十分经济的手段。

【技术实现步骤摘要】
一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法及其应用与试剂盒
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法及其应用与试剂盒，用于确定在接受器官移植的病人体内是否产生了导致慢性器官排斥的抗体。
技术介绍
外科移植是目前根治器官衰竭最有效的途径，它不但需要严格广泛的医疗护理，还要求器官供者和受者之间的人类组织相容抗原相同以避免受者的免疫系统攻击外来的组织。如果二者的人类组织相容抗原类型不同，受者体内天然存在或诱导合成的抗体将攻击移植的器官组织。然而，在临床实践中，器官供者和资源十分限制，供者和受者之间的抗原相同程度变异相当巨大。据报道，8－25％的接受器官移植的病人都会产生针对供者特异的抗体即DSA,其中50％的病人在五年内将出现抗体介导的排斥反应并最终导致器官移植失败。然而，不是所有的DSA都能介导排斥反应。虽然DSA的某些特性包括亚型、滴度、特异性、结合力及克隆性与致病性有密切关系，但是目前尚无试验手段直接观察DSA与供者血管细胞的相互作用。这是鉴定DSA的致病性的关键步骤；DSA与供者细胞的相互作用才是决定器官在受者体内生存时间的决定性因素。迄今为止，LUMINEX公司生产的单抗原微球是临床上检测DSA最常用的方法。它评估的原理是在每个微球上均包被不同的人类组织相容抗原，它们可特异性地结合病人血内的DSA，从而确定它们的种类和强度。虽然单抗原微球法可以提供DSA在免疫学上的特性，但是，它不能完全确立DSA在介导细胞功能方面的作用。这在一定程度上限制了它在指导临床医师决策的应有的价值。C1q单抗原球检测法是在临床中使用的鉴定致病性DSA的试验。C1q受抗体活化并启动经典补体激活途径，其产物C4d沉积在组织中导致细胞毒性溶解，造成移植的器官功能丧失。迄今为止，大量科学研究与临床结果认为补体激活是急性排斥反应的主要途径，而慢性排斥反应与非补体途径的激活更相关。抗体介导的排斥反应是一个极为复杂包含众多机制的过程。具有致病性的DSA不但要与血管内皮细胞表面的人类组织相容抗原紧密结合，而且能进一步触发细胞内的信号传导通路，才会造成内皮细胞激活。持续激活的内皮细胞一方面加速释放炎性因子，另一方面在细胞表面增加粘附蛋白。这些反应的综合结果是在毛细血管周围侵润大量炎性细胞和细胞增殖，进一步发展为血管阻塞，组织坏死。由此可见，精准评估DSA的致病性必须依赖于DSA与血管内皮细胞的相互作用。综上所述，慢性抗体介导的排斥反应是当今器官移植医学首要解决的问题，它不仅增加了病人的经济负担，而且令移植的器官在体内不能发挥予期的功能。本专利技术建立了洞察DSA与血管内皮细胞相互作用的检测手段；它可特异地，准确地确定DSA的致病性。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的是解决功能性地检测抗体介导的器官排异的方法。所述再构细胞板的血管内皮细胞培养物均具有确定的人类白细胞组织相容抗原谱。确定抗原的方法是提取血管内皮细胞培养物DNA，使用微量聚合酶链式反应试剂盒，美国OneLamda产品，将人类白细胞组织相容抗原分类为：HLA－A，HLA－B，HLA－C，HLA－DR，HLA－DQ，和HLA－DP。将所获得的细胞抗原的信息储存在数据库内；确定抗原的细胞冻存在液氮中备用。本专利技术所述的诊断试剂盒使用抗原确定的血管内皮细胞培养物，它们能与DSA特异地结合并被DSA激活。在加入病人血清后，致病性DSA激活细胞内的信号传导通路，导致细胞表面粘附蛋白表达增加，并释放引起炎性反应的细胞因子和介质；而非致病性DSA不能激活上述传导通路。通过测定细胞激活的产物，本试剂盒可准确地区别致病与非致病性DSA，为临床医师提供了可靠的诊断依据。本专利技术所述的诊断试剂盒使用抗原确定的血管内皮细胞培养物是依据供者白细胞相容抗原分型而选择的；它们有序地种植在微孔培养板上，为再构细胞板。所述血管内皮细胞为高度选择性，亦是，所述细胞诊断试剂盒内再构细胞板的设计是由医师依据供者的人类白细胞组织相容抗原的类型而为受者特殊制定的。当医师申请使用此诊断试剂的同时，亦提交已植入病人体内供者器官的人类白细胞组织相容抗原的分型即HLA－A，HLA－B，HLA－C，HLA－DR，HLA－DQ，HLA－DP。依据此抗原分型谱在细胞库内提取、复苏、种植表达这些抗原的细胞于96-孔细胞培养微孔板的底部，种植数量为3000-4000活细胞/孔。本专利技术所述的一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法，包括如下步骤：(1)依据病人血样中要鉴定DSA的分型，在细胞库内选择表达与DSA类型相对应抗原的血管内皮细胞；(2)将所述血管内皮细胞种植在96-孔细胞培养微孔板的底部，详见附图2，每孔含3000-4000活细胞，所述种植活细胞的微孔板定义为再构细胞板；(3)向测试的每孔内加入病人血清，在一定条件下孵育一段时间；(4)收集再构细胞板孔内的上清液，测定血管内皮细胞与血清反应后释放的生物活性细胞因子；(5)用体积比4％聚甲醛固定种植在再构细胞板的底部血管内皮细胞，采用免疫荧光组化的方法分析细胞表面粘附分子；(6)准备试剂盒；(7)参考试剂盒内提供的阳性与阴性对照血清数值，用于确定病人血清与血管内皮细胞的反应幅度。本专利技术所采用的血管内皮细胞培养物来自正常人群志愿者。原代细胞自分离培养后，种植于血管内皮细胞板用于测定DSA的细胞传代次数低于3代。本专利技术采用两种手段判断细胞反应终点：(1)使用免疫酶联试剂盒定量培养上清液内炎性因子，敏感度为0.1-1.0pg/mL；(2)使用免疫荧光组化定量细胞表面粘附分子，以同时测定的阴性和阳性标本为对照判定结果。所述血管内皮细胞培养在本诊断试剂盒中的特征为：(1)从正常人群组织中分离；(2)与供者人类白细胞组织相容抗原相同的培养物；(3)与器官移植受者血清孵育后，具有致病性的DSA可激活损伤血管内皮细胞。所述血管内皮细胞在DSA刺激下的反应，在诊断试剂盒中的特征为：(1)使用免疫酶联法测定上清液内白细胞介素－1β，白细胞介素－2，白细胞介素－6，白细胞介素－8(IL-8)，单核细胞趋化蛋白－1(MCP-1)，干扰素，粒单－克隆刺激因子，单核－克隆刺激因子，肿瘤坏死因子－A(TNF－A)；(2)使用免疫荧光测定细胞表面细胞间粘附分子－1(ICAM-1)和血管细胞粘附分子(VCAM-1)。致病性DSA引发血管内皮细胞的激活与损伤，因而，增加上述分子的表达与释放，非致病性DSA不引发上述分子的改变。优选的，血管内皮细胞表达的人类组织相容抗原与接受器官移植的病人DSA抗体相对应。优选的，所述的一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法步骤(3)中，所述条件为摄氏温度35℃－37℃、二氧化碳分压为4％－5％。优选的，所述的一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法步骤(3)中，所述病人血清和血管内皮细胞的反应时间是24小时。优选的，人类组织相容抗原的测定使用低分辨分型方法。优选的，血管内皮细胞来自人的新鲜标本，为血管片段、脂肪、肌肉、皮肤、脐带、肝、肺、肾中的一种。优选的，所述的一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法的用途是检测接受器官移植后的病人血液内的DSA是否具有攻击供者组织的能力的应用。优选的，所述的一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法的用途是揭示病本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法，其特征在于：(1)依据病人血样中要鉴定DSA的分型，在细胞库内选择表达与DSA类型相对应抗原的血管内皮细胞；(2)将所述血管内皮细胞种植在96‑孔细胞培养微孔板的底部，每孔含3000‑4000活细胞，所述种植活细胞的微孔板定义为再构细胞板；(3)向测试的每孔内加入病人血清，在一定条件下孵育一段时间；(4)收集再构细胞板孔内的上清液，测定血管内皮细胞与血清反应后释放的生物活性细胞因子；(5)用体积比4％聚甲醛固定种植在再构细胞板的底部血管内皮细胞，采用免疫荧光组化的方法分析细胞表面粘附分子；(6)准备试剂盒；(7)参考试剂盒内提供的阳性与阴性对照血清数值，用于确定病人血清与血管内皮细胞的反应幅度。

【技术特征摘要】
1.一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法，其特征在于：(1)依据病人血样中要鉴定DSA的分型，在细胞库内选择表达与DSA类型相对应抗原的血管内皮细胞；(2)将所述血管内皮细胞种植在96-孔细胞培养微孔板的底部，每孔含3000-4000活细胞，所述种植活细胞的微孔板定义为再构细胞板；(3)向测试的每孔内加入病人血清，在一定条件下孵育一段时间；(4)收集再构细胞板孔内的上清液，测定血管内皮细胞与血清反应后释放的生物活性细胞因子；(5)用体积比4％聚甲醛固定种植在再构细胞板的底部血管内皮细胞，采用免疫荧光组化的方法分析细胞表面粘附分子；(6)准备试剂盒；(7)参考试剂盒内提供的阳性与阴性对照血清数值，用于确定病人血清与血管内皮细胞的反应幅度。2.根据权利要求1所述的一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法，其特征在于：使用了与供者的人类组织相容抗原表达相同的血管内皮细胞培养物，血管内皮细胞培养物与病人血清的相互作用是特异的。3.根据权利要求1所述的一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法，其特征在于：所述再构细胞板为高度选择性血管内皮细胞；当医师申请使用此诊断试剂的同时，应提交已植入病人体内供者器官的人类白细胞组织相容抗原的分型即HLA－A，HLA－B，HLA－C，HLA－DR，HLA－DQ，HLA－DP；依据此抗原分型谱在细胞库内提取、复苏、种植表达这些抗原的细胞于96-孔细胞培养微孔板的底部；所述细胞诊断试剂盒内的血管内皮细胞板的设计是依据供者的人类白细胞组织相容抗原的类型而为受者制定的，因而有高度的选择性。4.根据权利要求1所述的一种功能性地检测抗体介导的器官排异的方法，其特征在于：血管内皮细胞表达的人类组织相容抗原与接受器官移植的病人DSA抗体相对应。5.根据权利要求1所述的一种功能性地检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：石强，
申请(专利权)人：石强，
类型：发明
国别省市：美国,US