一种基于电化学阻抗相角分析的微生物检测方法技术

本发明专利技术提供一种基于电化学阻抗相角分析的微生物检测方法。该检测方法包括：基于待测样品催化产物的电化学阻抗相角谱，通过曲线拟合，得到最大相位角对应的频率值，利用最大相位角对应的频率值与目标微生物浓度的关系曲线，获取待测样品中目标微生物的浓度值。本发明专利技术使用PCB电极检测电化学阻抗相角谱，该微生物检测方法可用于微生物的快速定量分析，准确地得到待测样品中特定微生物的浓度。

A method of microbial detection based on electrochemical impedance phase angle analysis

The present invention provides a microbiological detection method based on electrochemical impedance phase angle analysis. The detecting method comprises: electrochemical impedance angle samples to be measured based on the catalytic product spectrum, through the curve fitting, get the maximum frequency phase angle value corresponding to the maximum phase angle, the frequency value corresponding to the relationship between the curve and the target concentration of microorganisms, get tested concentration in the sample value of target microorganisms. The invention uses the PCB electrode to detect the electrochemical impedance phase angle spectrum, and the microbiological detection method can be used for rapid quantitative analysis of microorganisms and accurately obtain the concentration of a particular microorganism in a sample to be tested.

【技术实现步骤摘要】
一种基于电化学阻抗相角分析的微生物检测方法
本专利技术涉及生物检测
，更具体地，涉及一种基于电化学阻抗相角分析的微生物检测方法。
技术介绍
病原微生物的快速筛查是食品安全和动物疫病防控的关键，现有的检测方法主要包括培养法(对细菌而言)或分离法(对病毒而言)、聚合酶链式反应法(PCR)和免疫分析法。传统的培养或分离法准确性及灵敏度高，但耗时长；PCR法虽然检测时间短，灵敏度高，但是核酸提取操作复杂，而且需要昂贵的仪器设备和专业的技术人员；免疫分析法虽然操作简单，但其检测灵敏度偏低，假阳性率偏高。阻抗生物传感器具有检测速度快、操作简单、灵敏度高等优点，在食源性致病菌检测中逐步得到了越来越多的应用。如专利“一种基于免疫磁分离和脲酶催化的微生物检测方法”(专利申请号：CN201510202501.2)所述，先利用第一生物识别元件修饰的磁性颗粒对目标微生物进行分离和富集，再与由脲酶和第二生物识别元件共同修饰的金颗粒进行免疫结合，然后利用脲酶催化尿素水解，最后利用叉指阵列微电极作为传感器，对阻抗幅值变化进行检测，并利用阻抗幅值变化与待分析物浓度之间的标定曲线来计算得到目标微生物的数量，实现微生物的快速定量检测。这种方法仅仅对电化学阻抗幅值变化进行目标微生物分析，但电化阻抗数据除了幅值信息外，还包含了相角信息，然而目前并无报道利用PCB电极结合电化学阻抗的相角信息进行微生物检测的方法。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供了一种基于电化学阻抗相角分析的微生物检测方法，包括：基于待测样品催化产物的电化学阻抗相角谱，通过曲线拟合，得到最大相位角对应的频率值，利用最大相位角对应的频率值与目标微生物浓度的关系曲线，获取待测样品中目标微生物的浓度值；其中，所述电化学阻抗相角谱是使用PCB电极检测得到。优选地，所述PCB电极包括PCB电路板和PDMS通道。优选地，所述最大相位角对应的频率值与目标微生物浓度的关系曲线的建立为：基于多种含有已知浓度目标微生物的样品催化产物的电化学阻抗相角谱，通过二次曲线拟合，获取最大相位角对应的特征频率，再通过线性拟合，建立所述特征频率与目标微生物浓度之间的关系曲线。优选地，基于含有多种已知浓度目标微生物的样品催化产物的电化学阻抗相角谱具体为：S11.利用所述目标微生物的第一生物识别元件修饰的免疫磁性元件对所述目标微生物进行捕获，通过磁分离得到纯化的磁性元件-目标微生物复合体；S12.利用脲酶和所述目标微生物的第二生物识别元件共同修饰的纳米金与所述磁珠-目标微生物复合体进行反应，形成磁性元件-目标微生物-纳米金-脲酶复合体；S13.利用所述磁性元件-目标微生物-纳米金-脲酶复合体上的脲酶催化尿素水解，利用所述PCB电极测量得到催化水解后的溶液的电化学阻抗相角谱。优选地，S11中所述目标微生物的第一生物识别元件修饰的免疫磁性元件的制备如下：将链霉亲和素固定在羧基磁性元件上，形成链霉亲和素化磁性元件，再将生物素修饰在所述目标微生物的第一生物识别元件上，形成生物素化第一生物识别元件，然后将所述链霉亲和素化磁性元件和所述生物素化第一生物识别元件进行混合孵育，所述链霉亲和素化磁性元件上的链霉亲和素与所述第一生物识别元件上的生物素偶联，最后通过磁分离除去多余的所述第一生物识别元件，即可得到所述目标微生物的第一生物识别元件修饰的免疫磁性元件。优选地，S12中所述脲酶和所述目标微生物的第二生物识别元件共同修饰的纳米金的制备如下：利用柠檬酸三钠还原法制备纳米金，再将含目标微生物第二生物识别元件的溶液与纳米金混合孵育，然后加入含脲酶的溶液与纳米金混合孵育，所述第二生物识别元件和所述脲酶均通过静电方式吸附至纳米金，即得所述脲酶和所述目标微生物的第二生物识别元件共同修饰的纳米金。更优选地，S12中所述脲酶和所述目标微生物的第二生物识别元件共同修饰的纳米金的制备具体如下：先利用柠檬酸三纳还原法制备纳米金；再利用K2CO3溶液将纳米金的pH调节至7.0；然后将目标微生物的第二生物识别元件逐滴加入纳米金，搅拌孵育；接着再逐滴加入脲酶，搅拌孵育，最后，分别利用PEG和BSA进行封闭，离心除去多余的第二生物识别元件和脲酶，即可得到所述脲酶和所述第二生物识别元件共同修饰的纳米金。优选地，所述第一生物识别元件和第二生物识别元件与目标微生物的结合位点不同。优选地，所述通过曲线拟合，获取最大相位角对应的频率与目标微生物浓度的关系曲线具体为：基于所述电化学阻抗相角谱，通过二次曲线拟合，得到相角谱的拟合函数，求导，获取最大相位角对应的特征频率。优选地，所述拟合函数为：y＝ax2+bx+c，其中，y为相角，x为频率；最大相位角对应的特征频率x＝-b/(2a)。优选地，所述目标微生物为食源性致病菌，优选为单增李斯特菌。优选地，所述目标微生物为单增李斯特菌，所述第一生物识别元件为单克隆抗体，所述第二生物识别元件为多克隆抗体。本专利技术所提供的微生物检测方法通过使用PCB电极检测得到电化学阻抗相角谱，建立样品催化产物的电化学阻抗相角谱中最大相位角对应的频率与目标微生物浓度的关系曲线，可以很准确地得到待测样品中微生物的浓度。另外，通过生物识别元件修饰的免疫磁性元件分离并富集目标微生物，提高了目标微生物的浓度，减少了样本背景中其它分子的干扰影响，之后利用脲酶催化反应改变尿素溶液的盐离子浓度，产生铵根离子和碳酸根离子，有效地放大了检测信号，无需在PCB电极上进行任何修饰即可实现阻抗检测。同时，本专利技术的方法背景噪声低，系统信噪比高，检测精度高，检测时间短，操作简单，成本低，一致性好。附图说明图1为根据本专利技术一个优选实施例中PCB电极的电路图。图2为根据本专利技术一个优选实施例中微生物检测方法中样品前处理过程图；图3为根据本专利技术实施例1中不同浓度的碳酸铵溶液的阻抗相角谱图；图4为根据本专利技术实施例1中最大相角所对应的特征频率与碳酸铵溶液浓度的曲线图；图5为根据本专利技术实施例2中不同浓度的单增李斯特菌的阻抗相角谱图；图6为根据本专利技术实施例2中最大相角所对应的特征频率与单增李斯特菌浓度的曲线图；图7为根据本专利技术实施例3中使用叉指阵列微电极和PCB电极分别对不同浓度的碳酸铵溶液进行测量得到的阻抗变化值与碳酸铵浓度的曲线图。具体实施方式下面结合附图和实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。本专利技术提供了一种基于电化学阻抗相角分析的微生物检测方法，包括：基于待测样品催化产物的电化学阻抗相角谱，通过曲线拟合，得到最大相位角对应的频率值，利用最大相位角对应的频率值与目标微生物浓度的关系曲线，获取待测样品中目标微生物的浓度值；其中，电化学阻抗相角谱是使用PCB电极检测得到。本专利技术通过PCB电极检测并获取数据，检测时间短，检测成本显著低于微电极。在本专利技术一个优选实施方式中，PCB电极包括PCB电路板和PDMS通道。电极的设计具体如下：利用软件AltiumDesigner绘制PCB电极的PCB图，利用3D打印机制作通道模具，并浇筑PDMS通道。该电极主要包括两部分：PCB电路板和PDMS通道。PCB板的尺寸为4*2*0.1cm，板上包含10对金电极和一个USB接口，每个电极尺寸为6*0.1-6*0.2mm，电极间的间隔为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于电化学阻抗相角分析的微生物检测方法，包括：基于待测样品催化产物的电化学阻抗相角谱，通过曲线拟合，得到最大相位角对应的频率值，利用最大相位角对应的频率值与目标微生物浓度的关系曲线，获取待测样品中目标微生物的浓度值；其中，所述电化学阻抗相角谱是使用PCB电极检测得到。

【技术特征摘要】
1.一种基于电化学阻抗相角分析的微生物检测方法，包括：基于待测样品催化产物的电化学阻抗相角谱，通过曲线拟合，得到最大相位角对应的频率值，利用最大相位角对应的频率值与目标微生物浓度的关系曲线，获取待测样品中目标微生物的浓度值；其中，所述电化学阻抗相角谱是使用PCB电极检测得到。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCB电极包括PCB电路板和PDMS通道。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述最大相位角对应的频率值与目标微生物浓度的关系曲线的建立为：基于多种含有已知浓度目标微生物的样品催化产物的电化学阻抗相角谱，通过二次曲线拟合，获取最大相位角对应的特征频率，再通过线性拟合，建立所述特征频率与目标微生物浓度之间的关系曲线。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述基于含有多种已知浓度目标微生物的样品催化产物的电化学阻抗相角谱具体为：S11.利用所述目标微生物的第一生物识别元件修饰的免疫磁性元件对所述目标微生物进行捕获，通过磁分离得到纯化的磁性元件-目标微生物复合体；S12.利用脲酶和所述目标微生物的第二生物识别元件共同修饰的纳米金与所述磁性元件-目标微生物复合体进行反应，形成磁性元件-目标微生物-纳米金-脲酶复合体；S13.利用所述磁性元件-目标微生物-纳米金-脲酶复合体上的脲酶催化尿素水解，利用所述PCB电极测量得到催化水解后的溶液的电化学阻抗相角谱。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，S11中所述目标微生物的第一生物识别元件修饰的免疫磁...

【专利技术属性】
技术研发人员：林建涵，王蕾，王丹，黄凤春，姚岚，陈奇，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11