对含有蛋白的生物样品进行预处理的方法技术

本发明专利技术提供了在对生物样品中含有的蛋白质进行的免疫测定法中对生物样品进行预处理的方法。所述方法包括下述步骤：（1）在高于－80℃的温度下、特别是在－70℃或更高的温度下冷冻生物样品；（2）解冻经冷冻的生物样品；和（3）使用表面活性剂对生物样品进行增溶。

Method for pretreating biological samples containing protein

The present invention provides methods for the pretreatment of biological samples in immunoassays for proteins contained in biological samples. The method comprises the following steps: (1) higher than that in the 80 DEG C, especially in 70 degrees or higher temperature frozen biological samples; (2) biological samples by freezing thawing; and (3) the use of surfactants on biological samples were solubilized.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在对生物样品中含有的蛋白质进行的免疫测定法中对生物样品进行预处理的方法。本专利技术还涉及用于测定通过上述方法预处理的生物样品中含有的蛋白质的免疫测定法。
技术介绍
近年来，测量生物标志物的方法已被用作为获得可用于诊断多种疾病的信息的方法。“生物标志物”表示“作为对正常生物学过程、病理学过程或对治疗性介入的药理学应答的指标而被客观测量并评价的特性”（acharacteristicthatisobjectivelymeasuredandevaluatedasanindicatorofnormalbiologicprocesses,pathogenicprocesses,orpharmacologicresponsestoatherapeuticintervention.）（BIOMARKERSDEFINITIONSWORKINGGROUP:BIOMARKERSANDSURROGATEENDPOINTS:PREFERREDDEFINITIONSANDCONCEPTUALFRAMEWORK.CLINPHARMACOLTHER2001;69:89-95.）。更具体地，生物标志物是生物样品（例如体液（例如血清和尿）及组织）中含有的生物来源的材料。生物标志物被用作为定量检测体内生物学变化的指示物。为测量生物标志物，使用免疫测定法，例如ELISA（酶联免疫吸附测定法）、RIA（放射免疫测定法）和免疫色谱法。此类免疫测定法易于通过使用检验试剂盒来进行。另一方面，在对生物标志物的测量中可能产生假阳性和假阴性的问题。特别地，在对作为生物标志物的膜蛋白的测量中，因为检测用抗体所识别的位点被膜覆盖，该位点可能没有充分与抗体反应。因此，上文所述的使用检验试剂盒的方便的方法无法以高精确度检测生物标志物，因此一直需要可解决该问题的方法。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供在对生物样品中含有的蛋白质进行的免疫测定法中对生物样品进行预处理的方法，所述蛋白质特别是具有上述问题的膜蛋白。更优选地，本专利技术的一个目的是提供一种生物样品预处理方法，其可解决对生物样品中含有的蛋白质进行的免疫测定法中可能产生的假阳性和假阴性的问题，并且可增加测量精确度和/或测量灵敏度。本专利技术的另一目的是提供一种免疫测定法，其用于测定通过上述方法预处理的生物样品中含有的蛋白质，特别是膜蛋白。当对含有蛋白质（例如不可溶蛋白、特别是膜蛋白）的生物样品进行使用蛋白质作为生物标志物的免疫测定法时，通常在进行免疫测定法之前使用表面活性剂对目标蛋白进行增溶。本专利技术的专利技术人进行了锐意研究，以解决对此类生物样品进行的免疫测定法中存在的上述问题，本专利技术的专利技术人发现，一旦在高于－80℃的温度、特别是－70℃或更高的温度下冷冻含有蛋白质、特别是不可溶蛋白、例如膜蛋白的生物样品，然后对其进行解冻，就可以解决对蛋白质进行的免疫测定法中可能发生的上述问题，并且可增加测量精确度和/或测量灵敏度。已通过基于该发现进行的进一步的研究而完成了本专利技术。本专利技术包括以下内容。（I）对含有蛋白质的生物样品进行预处理的方法（I－1）在对生物样品中含有的蛋白质进行的免疫测定法中对生物样品进行预处理的方法，所述方法包括下述步骤：（1）在高于－80℃的温度、特别是－70℃或更高的温度下冷冻所述生物样品；（2）解冻经冷冻的生物样品；和（3）使用表面活性剂对所述生物样品进行增溶。（I－2）在对生物样品中含有的蛋白质进行的免疫测定法中对生物样品进行预处理的方法，所述方法包括下述步骤：（2’）对在高于－80℃的温度、特别是－70℃或更高的温度下冷冻的生物样品进行解冻；和（3）使用表面活性剂对所述生物样品进行增溶。（I－3）根据（I－1）或（I－2）所述的预处理方法，其中所述生物样品是动物的体液，所述动物包括人。（I－4）根据（I－3）所述的预处理方法，其中所述体液为尿。（I－5）根据（I－1）～（I－4）中任一项所述的预处理方法，其中用于增溶步骤（3）中的表面活性剂是非离子性表面活性剂。（I－6）根据（I－5）所述的预处理方法，其中所述非离子性表面活性剂是聚氧乙烯(10)辛基苯基醚。（I－7）根据（I－1）～（I－6）中任一项所述的预处理方法，其中所述免疫测定法为ELISA。（I－8）根据（I－1）～（I－7）中任一项所述的预处理方法，其中所述蛋白质是膜蛋白。（I－9）根据（I－8）中所述的预处理方法，其中所述膜蛋白是水通道蛋白。（II）对生物样品中含有的蛋白质进行的免疫测定法（II－1）一种免疫测定法，用于测定生物样品中含有的蛋白质，其中所述生物样品通过（I－1）～（I－9）中任一项所述的方法被预处理。（II－2）根据（II－1）所述的免疫测定法，其中所述蛋白质是膜蛋白。（II－3）根据（II－1）或（II－2）所述的免疫测定法，其中所述蛋白质是水通道蛋白。（II－4）根据（II－1）～（II－3）中任一项所述的免疫测定法，其为ELISA。本专利技术可提供一种对生物样品的预处理方法，以在对生物样品中含有的蛋白质（特别是膜蛋白）进行的免疫测定法中诱导充分的免疫应答。因此，本专利技术的方法可以以高准确度和高灵敏度测量生物样品中含有的膜蛋白，而通过使用传统免疫测定法进行测量时无法以足够高的准确度和/或灵敏度对其加以测量。附图简述图1显示了人AQP2基因（hAQP2）与用于对人AQP2基因（hAQP2）进行PCR的hAQP2/前半部分引物（hAQP2N－F、hAQP2N－R）和hAQP2/后半部分引物（hAQP2C－F、hAQP2C－R）之间的关系（参考制造例1（2））。图2显示了对参考制造例1（2）中克隆的hAQP2N（86－749）质粒No.1、2、3、5和6及hAQP2C（562－901）质粒No.1、2、3、4和6的序列与野生型人AQP2基因进行的关于基因长度和区域的比较。图3显示了在参考制造例1（4）中使用人AQP2合成肽抗体（抗人AQP2兔血清，PherMingen）对两种大肠杆菌（No.2和8）进行的SDS－PAGE/CBB染色（上图）和Western印迹分析的结果，其中，使用了IPTG前样品（诱导前）、IPTG后样品（诱导后）和通过对经诱导的大肠杆菌增溶获得的不可溶级分和可溶级分。图4（1）显示了参考制造例2中生产在Sf－9本文档来自技高网...

【技术保护点】
在对生物样品中含有的蛋白质进行的免疫测定法中对生物样品进行预处理的方法，所述方法包括下述步骤：（1）在高于－80℃的温度下冷冻所述生物样品；（2）解冻经冷冻的生物样品；和（3）使用表面活性剂对生物样品进行增溶。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.08.11 JP 2011-1762721.在对生物样品中含有的蛋白质进行的免疫测定法中对生物样
品进行预处理的方法，所述方法包括下述步骤：
（1）在高于－80℃的温度下冷冻所述生物样品；
（2）解冻经冷冻的生物样品；和
（3）使用表面活性剂对生物样品进行增溶。
2.在对生物样品中含有的蛋白质进行的免疫测定法中对生物样
品进行预处理的方法，所述方法包括下述步骤：
（2’）对在高于－80℃的温度下冷冻的生物样品进行解冻；和
（3）使用表面活性剂对生物样品进行增溶。
3.根据权利要求1或2所述的预处理方法，其中所述生物样品
是动物的体液，所述动物包括人。
4.根据权利要求3所述的预处理方法，其中所述体液为尿。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的预处理方法，其中用于增...

【专利技术属性】
技术研发人员：佐佐木成，大本安一，森丰树，岩田房子，村口正宏，
申请(专利权)人：大塚制药株式会社，国立大学法人东京医科齿科大学，
类型：发明
国别省市：日本;JP