一种检测甲氨蝶呤的ELISA试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术的提供了一种检测甲氨蝶呤的ELISA试剂盒及其应用，所述试剂盒包括如下试剂：包被甲氨蝶呤的96孔微孔板，甲氨蝶呤单克隆抗体，抗体稀释液，HRP标记羊抗鼠二抗，甲氨蝶呤标准品，洗液浓缩液，样本稀释液，TMB显色液以及终止液。本发明专利技术通过各试剂的组合及对试剂参数的改进，得到一种稳定、快速、简便的甲氨蝶呤检测试剂盒，且应用时所述试剂盒标准偏差值较小。能同时用于大剂量甲氨蝶呤使用患者的血药浓度检测以及小剂量甲氨蝶呤治疗量患者血清中药物浓度检测。

ELISA kit for detecting methotrexate and its application

ELISA provides a kit for detecting methotrexate and its application of the invention, the kit includes the following reagents: coated 96 well microtiter plate methotrexate, MTX monoclonal antibody, antibody dilution, HRP labeled Goat anti mouse two resistance, methotrexate standard, washing liquid concentrate, sample diluent, TMB. Color liquid and stop solution. The invention obtains a stable, fast and simple methotrexate detection kit through the combination of each reagent and the improvement of the reagent parameter, and the standard deviation value of the reagent box is smaller when applied. Serum concentrations of patients who can be administered simultaneously with high doses of methotrexate, as well as serum concentrations of small doses of methotrexate, are detected.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于免疫检测领域，具体涉及一种检测甲氨蝶呤的ELISA试剂盒及其应用。
技术介绍
甲氨蝶呤(MTX)是用于治疗癌症和自身免疫疾病的药物。它被设计为抗叶酸盐以抑制叶酸的代谢。在癌症治疗中，甲氨蝶呤通过阻断叶酸结合竞争性抑制二氢叶酸还原酶(DHFR)，DHFR将二氢叶酸转化为活性四氢叶酸。DHFR的抑制导致抑制嘌呤和嘧啶碱基的合成，有效限制DNA和RNA合成和癌细胞生长。在自身免疫疾病中，特别是在类风湿性关节炎的治疗中，甲氨蝶呤似乎影响几种通路，导致T细胞活化的抑制。这些作用包括抑制细胞间粘附分子的T细胞表达，抑制甲基转移酶活性和增加CD95敏感性，导致活性T细胞凋亡。监测甲氨蝶呤水平对于确保在治疗或治疗期间适当水平是重要的。高水平的甲氨蝶呤可以导致毒性和潜在的肾衰竭以及免疫抑制。此外，甲氨蝶呤已知与各种各样的药物相互作用，导致额外的并发症。确定来自受试者的样品中甲氨蝶呤的存在可以帮助解释研究结果。甲氨蝶呤被建立为类风湿关节炎的最有效和安全的治疗之一。安全性分析确保甲氨蝶呤将继续在新研究中与其他新药或既成药物联合使用。在其用作癌症治疗剂时也是如此。大剂量的MTX常用于肿瘤、白血病的治疗，最新的儿童急性淋巴性白血病诊疗方案提出甲氨蝶呤使用剂量为2～5g/(m2.24h)，患者血清浓度可高达20μmol/L，常用检测方法主要有高效液相色谱法、荧光偏振免疫法、酶放大免疫法。近年来MTX用于类风湿关节炎、干燥综合征、银屑病关节炎等系统性自身免疫性疾病的治疗，常用剂量为5～20mg/周，患者服药后24h内血清MTX浓度最高为20nmol/L，两者浓度相差了近1000倍。传统的检测方法很难检出，现常用高效液相色谱质谱法检测。但色谱质谱法样本前处理较复杂，操作步骤也相对繁琐，且色谱质谱仪造价昂贵，检测成本高，不适合与大样本检测及基层开展。
技术实现思路
针对现有技术中的上述缺陷，本专利技术的主要目的在于提供一种检测甲氨蝶呤的ELISA试剂盒及其应用，所述试剂盒能快速、简便、稳定的检测样本中的甲氨蝶呤，且标准偏差值较小。为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案:一种检测甲氨蝶呤的ELISA试剂盒，所述试剂盒包括如下试剂：包被甲氨蝶呤的96孔微孔板，甲氨蝶呤单克隆抗体，抗体稀释液，HRP标记羊抗鼠二抗，甲氨蝶呤标准品，洗液浓缩液，样本稀释液，TMB显色液以及终止液。作为进一步的优选，所述包被甲氨蝶呤的96孔微孔板的制备方法包括如下步骤：采用包被缓冲液将包被原稀释，将稀释后的所述包被原加入至微孔中，以封板膜贴封，包被过夜或恒温箱中包被温育2-4h；所述包被过夜或温育后，甩掉板中液体后拍干，洗板，拍干，每孔加入封闭液，以封板膜贴封，于恒温箱中温育1-3h封闭；所述封闭后，取板拍干，加入浸板液，于恒温箱中温育1-3h浸板；所述浸板后，取板拍干，将板抽真空。作为进一步的优选，所述包被原包括甲氨蝶呤-鸡蛋清白蛋白。作为进一步的优选，所述包被缓冲液包括CB缓冲液；所述洗板的洗液包括1×TBST溶液，所述封闭液包括10×PBS溶液、牛血清以及牛血清白蛋白，所述浸板液包括10×PBS溶液、蔗糖及海藻糖。作为进一步的优选，所述包被过夜的温度为4℃，所述恒温箱的温度为37℃。作为进一步的优选，所述甲氨蝶呤单克隆抗体由保藏号为CCTCCNO:C201726的杂交瘤细胞所分泌产生。作为进一步的优选，所述抗体稀释液包括10×PBS溶液、2％牛血清白蛋白以及10％牛血清。作为进一步的优选，所述样本稀释液包括PBS溶液和溴酚红指示剂。作为进一步的优选，所述终止液包括2-3mol/LH2SO4溶液。作为进一步的优选，所述洗液浓缩液为10×TBST溶液。一种检测甲氨蝶呤的ELISA试剂盒的应用，其特征在于：所述试剂盒用于大剂量甲氨蝶呤使用患者的血药浓度检测以及小剂量甲氨蝶呤治疗量患者血清中药物浓度检测。本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术通过各试剂的组合及对试剂参数的改进，得到一种稳定、快速、简便的甲氨蝶呤检测试剂盒，且应用时所述试剂盒标准偏差值较小。(2)应用本专利技术试剂盒检测样本中的甲氨蝶呤时，样本前处理较色谱质谱法简便，操作步骤简化，且本专利技术试剂盒不需要使用昂贵的仪器，检测成本低，适合大样本检测及基层开展。(3)通过在本专利技术试剂盒测定缓冲液中连续稀释潜在的交叉反应物并在测定中运行它们来测定分析的特异性。结果表明，甲氨蝶呤的代谢物，叶酸类似物，和其他类似物等和甲氨蝶呤结构类似的物质在分析中被定量检测；本专利技术试剂盒的特异性高。(4)本专利技术试剂盒灵敏度和准确度高，抗干扰性能好，甲氨蝶呤测定时不与主要代谢物7-羟基甲氨蝶呤交叉反应。(5)本专利技术试剂盒能同时用于大剂量MTX化疗和小剂量治疗风湿性关节炎等自身免疫性疾病时的MTX血药浓度检测。附图说明图1为本专利技术实施例1检测甲氨蝶呤的ELISA试剂盒的标准曲线拟合示意图。具体实施方式本专利技术通过提供一种检测甲氨蝶呤的ELISA试剂盒及其应用，所述试剂盒能快速、简便、稳定的检测样本中的甲氨蝶呤，且标准偏差值较小。现有检测方法例如高效液相色谱法可将药物与代谢产物以及内源性物质分离，具有专一性强的特点，是检测MTX血浆浓度的金标准，但HPLC法需复杂的前处理过程和较长的测定时间，不适合临床检测所需的操作简便、自动化程度高、测定周期短等要求。而例如免疫法具有快速、易操作的特点，但其结果易受交叉反应影响，目前的试剂盒在检测甲氨蝶呤的过程中，常有交叉反应明显，检测时间长等缺点。因此，建立一种稳定、快速、简便、成本低的MTX检测方法具有重要意义。ELISA是一种简便、灵敏度及特异度高的检测方法，可用于各种血药浓度检测。间接竞争ELISA法可检测MTX的血药浓度为μg/mL数量级，可用于大剂量MTX使用患者的血药浓度检测。小剂量治疗量的自身免疫性疾病患者血清中MTX浓度为ng/mL数量级，传统的ELISA检测方法无法检测MTX小剂量治疗量患者血清中药物浓度。由此需要开发一种能通用于大剂量MTX化疗和小剂量治疗风湿性关节炎等自身免疫性疾病时候的检测血药浓度。为了解决上述缺陷，本专利技术实施例的主要思路是：本专利技术实施例检测甲氨蝶呤的ELISA试剂盒，包括如下试剂：包被甲氨蝶呤的96孔微孔板，甲氨蝶呤单克隆抗体，抗体稀释液，HRP标记羊抗鼠二抗，甲氨蝶呤标准品，洗液浓缩液，样本稀释液，TMB显色液以及终止液。包被甲氨蝶呤的96孔微孔板制备方法如下：a.包被：采用包被缓冲溶液将包被原稀释至适合的浓度，将其加入至微孔中，每孔100ul，以封板膜贴封，4℃包被过夜或恒温箱中37℃包被温育2h；b.封闭：过夜包被或37℃包被后，甩掉板中液体后拍干，洗板两次，洗液为1×TBST，每孔250ul，洗板浸泡时间30s。洗板完毕后拍干，每孔加入封闭液200ul，以封板膜贴封，于37℃恒温箱中温育1.5h，设定温度37℃；c.浸板：封闭后，取板拍干，加入200ul浸板液，于37℃恒温箱中温育2h；d.备用：取板拍干后，将板抽真空，放置4℃备用。所述试剂盒可用于大剂量MTX使用患者的血药浓度检测以及小剂量MTX治疗量患者血清中药物浓度检测。为了让本专利技术之上述和其它目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特举数实施例，来说明本专利技术所述之检测甲氨本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测甲氨蝶呤的ELISA试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如下试剂：包被甲氨蝶呤的96孔微孔板，甲氨蝶呤单克隆抗体，抗体稀释液，HRP标记羊抗鼠二抗，甲氨蝶呤标准品，洗液浓缩液，样本稀释液，TMB显色液以及终止液。

【技术特征摘要】
1.一种检测甲氨蝶呤的ELISA试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如下试剂：包被甲氨蝶呤的96孔微孔板，甲氨蝶呤单克隆抗体，抗体稀释液，HRP标记羊抗鼠二抗，甲氨蝶呤标准品，洗液浓缩液，样本稀释液，TMB显色液以及终止液。2.根据权利要求1所述的检测甲氨蝶呤的ELISA试剂盒，其特征在于：所述包被甲氨蝶呤的96孔微孔板的制备方法包括如下步骤：采用包被缓冲液将包被原稀释，将稀释后的所述包被原加入至微孔中，以封板膜贴封，包被过夜或恒温箱中包被温育2-4h；所述包被过夜或温育后，甩掉板中液体后拍干，洗板，拍干，每孔加入封闭液，以封板膜贴封，于恒温箱中温育1-3h封闭；所述封闭后，取板拍干，加入浸板液，于恒温箱中温育1-3h浸板；所述浸板后，取板拍干，将板抽真空。3.根据权利要求2所述的检测甲氨蝶呤的ELISA试剂盒，其特征在于：所述包被原包括甲氨蝶呤-鸡蛋清白蛋白。4.根据权利要求2所述的检测甲氨蝶呤的ELISA试剂盒，其特征在于：所述包被缓冲液包括CB缓冲液；所述洗板的洗液包括1×TBST溶液，...

【专利技术属性】
技术研发人员：方勇飞，牟方祥，吴红，陈思，闫彩霞，陈欣，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：重庆;50