一种双通道荧光成像检测活细胞中微量Al制造技术

本发明专利技术公开一种双通道荧光成像检测活细胞中微量Al

【技术实现步骤摘要】
一种双通道荧光成像检测活细胞中微量Al3+的方法
本专利技术涉及一种双通道荧光成像检测活细胞中微量离子的方法，特别是一种双通道荧光成像检测活细胞中微量Al3+的方法。
技术介绍
铝是地壳中含量最丰富的第三种元素，日常生活中作为包装材料的铝箔、容器材料、药物制剂、漂白剂、造纸工业、食品添加剂、药物包装等被广泛使用。众所周知，对生命体而言，铝不是一种必须元素，它对人类健康会产生明显不利的影响。在各种生物和环境相关的重要金属离子中，由于铝对环境和人类健康的毒性作用，铝的检测尤为重要。而且，以铝为基础的药物如止汗药、抗溃疡药、抗酸剂等对人体健康的危害更甚于食物中铝离子的污染。过量铝的摄入与骨质疏松症和贫血症有关，因其影响肠胃中钙和血液中铁的吸收。在活细胞和组织中能够发现离子形态的铝，在被排泄出体内之前，铝离子能滞留在细胞和组织中更长的时间。在以毒性金属离子研究为中心的生物化学研究中，Al3+已经凸显其重要性，被建议为一种有助于病原学研究人类多种神经障碍症的影响因子。人类中枢神经系统受损是导致阿尔茨海默症、帕金森氏综合症和肌萎缩性骨髓侧索硬化症等的主要因素。已被证实，细胞内蛋白质的转换及在细胞生命周期中光解和蛋白质抗水解系统的不平衡过程中，铝都发挥了重要的作用。上述不利于人类健康的效应使Al3+在金属离子识别中成为一个重要的目标，迫切需要方便、灵敏、选择性的检测生物体系中Al3+的方法。传统的Al3+分析技术存在诸如破坏样品、耗时、样品前处理繁琐、设备复杂等问题，限制了不能快速、在线地检测，特别不适用于特殊的生物样品检测。荧光探针能实时传感生物学相关的重要离子并能实现体内外荧光成像，在生物成像、临床诊断、现代医学和生物科学中已经成为不可或缺的重要工具。灵敏的细胞内Al3+的生物成像是理解Al3+如何诱导人类疾病潜在机制的先决条件。然而，相对于其他金属离子，Al3+的检测由于缺乏光谱特征和较弱的配合能力一直存在困难。因此，现有方法检测活细胞中微量Al3+时，存在试剂与Al3+的配合能力困难，检测不方便，可视性差，灵敏度低，选择性差，易受其他离子的干扰，且不能实时在线检测的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种双通道荧光成像检测活细胞中微量Al3+的方法，本专利技术方法中探针与Al3+的配合能力好，检测方便，可视性好，灵敏度高、选择性好，受其他离子的干扰小，且能实现实时在线检测。本专利技术的技术方案：一种双通道荧光成像检测活细胞中微量Al3+的方法，是以三[二(萘基硫脲基)-罗丹明甲酰氨基]乙基胺，作为双通道荧光成像检测活性细胞中微量Al3+的荧光成像探针，通过双通道荧光成像检测活性细胞中微量Al3+；所述探针化学结构式为：前述的双通道荧光成像检测活细胞中微量Al3+的方法中，所述的通过双通道荧光成像检测活性细胞中微量Al3+；是先用探针与细胞孵化使探针进入细胞内，再将孵化有探针的细胞与Al3+孵化，使探针与Al3+在细胞内结合生成能发射特征波长荧光的探针-Al3+配合物，实现探针对细胞内离子染色成像，用荧光倒置显微镜观测孵化后的活性细胞荧光像；具体包括以下步骤：(1)细胞培养：活性细胞经复苏接种于含10％胎牛血清以及含1％双抗的改良型RPMI1640的培养基中，在温度为37℃，5％CO2及饱和湿度为100％的培养箱中培养，每隔2-3天传代1次，选择生长状态良好的细胞接种于12孔板中培养，密度为2×104个/ml，次日用新鲜培养基清洗细胞；(2)探针对细胞孵育：将步骤(1)的细胞中加入含10～40μM探针的培养液中，培养液的组成为90％培养基，8％H2O，2％乙腈，培养箱内孵育20～60min，吸出含探针的培养液，用新鲜的培养基清洗细胞，置于荧光倒置显微镜下分别进行场亮场和暗场拍照，明场下观察到细胞清晰的图像，暗场下没有观察到细胞图像；(3)Al3+对细胞染色：在步骤(2)的细胞中加入含50～120μMAl3+的培养液，培养液的组成为90％培养基和10％H2O，培养箱内孵育20～60min，吸出含Al3+的培养液，用新鲜的培养基清洗细胞，置于荧光倒置显微镜的绿色通道下观察探针对细胞内Al3+染色后的荧光像，细胞呈现明亮的绿色荧光，拍摄得到清晰的绿色荧光细胞轮廓影像，探针在活性细胞中检测到微量Al3+离子；(4)再将步骤(3)经探针和Al3+分别染色后的细胞置于倒置荧光显微镜红色通道下观察探针对细胞内Al3+染色后的荧光像，细胞呈现明亮的红色荧光，拍摄得到清晰的红色荧光细胞轮廓影像，探针在活性细胞中检测到微量Al3+离子。前述的双通道荧光成像检测活细胞中微量Al3+的方法中，所述的荧光倒置显微镜；是绿色通道的激发波长为450nm～490nm，红色通道的激发波长为510nm～550nm的荧光倒置显微镜。前述的双通道荧光成像检测活细胞中微量Al3+的方法中，所述的1640培养基；是RPMI1640培养基；RPMI为英文RoswellParkMemorialInstitute的缩写，代指洛斯维·帕克纪念研究所，RPMI是该研究所研发的一类细胞培养基，1640是培养基代号。前述的双通道荧光成像检测活细胞中微量Al3+的方法中，所述的活性细胞是；人体前列腺癌细胞，简称PC3细胞。前述的双通道荧光成像检测活细胞中微量Al3+的方法中，所述的探针；是按下述合成路线合成的：前述的双通道荧光成像检测活细胞中微量Al3+的方法中，所述的探针；是这样制备的：在100ml的三口烧瓶中，加入三(2-氨乙基)胺27.36mmol、罗丹明B3.42mmol和60ml的无水乙醇，氮气保护下回流36h，减压蒸去乙醇，用100ml二氯甲烷萃取3次，有机相用无水硫酸镁干燥过夜，蒸去溶剂，得红色粘稠状物，硅胶柱层析分离，洗脱液为体积比为9/1/1的甲醇/三氯甲烷/三乙胺，得1.71g无色粘稠状中间体；在250ml的三口瓶中，加入中间体2.03mmol、120ml三氯甲烷和1-萘异硫氰酸酯4.00mmol，氮气保护下58-62℃反应过夜，蒸去溶剂，硅胶柱层析分离，洗脱液为体积比为7/3的乙酸乙酯/正己烷，得白色固体。专利技术人对本专利技术方法进行了长期的大量的试验研究，以下是部分试验：1、按实施例1进行制备的探针，溶于体积比为49/1的乙腈/水溶液中，配制成探针浓度为10μM的溶液，分别不加金属离子或加入200μM金属离子Al3+，Li+，Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Ba2+，Sr2+，Hg2+，Pb2+，Cd2+，Zn2+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Ag+，Fe3+后的荧光光谱。见图1，Al3+的加入使探针在590nm处的荧光强度显著增强，而其他上述实验金属离子的加入均不改变探针的荧光光谱和强度，表明在此条件下，探针能选择性检测Al3+。测试的激发波长为240nm，发射波长为590nm。2、按实施例1进行制备的探针，溶于体积比为49/1的乙腈/水溶液中，配制成探针浓度为10μM的溶液，分别加入200μM的金属离子Al3+，Li+，Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Ba2+，Sr2+，Hg2+，Pb2+，Cd2+，Zn2+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Ag+，Fe3+后，测定590nm处的荧光强度值，仅有Al3+的加入能使探针产生强烈荧光。再分别本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双通道荧光成像检测活细胞中微量Al

【技术特征摘要】
1.一种双通道荧光成像检测活细胞中微量Al3+的方法，其特征在于：是以三[二(萘基硫脲基)-罗丹明甲酰氨基]乙基胺，作为双通道荧光成像检测活性细胞中微量Al3+的荧光成像探针，通过双通道荧光成像检测活性细胞中微量Al3+；所述探针化学结构式为：2.如权利要求1所述的双通道荧光成像检测活细胞中微量Al3+的方法，其特征在于：所述的通过双通道荧光成像检测活性细胞中微量Al3+；是先用探针与细胞孵化使探针进入细胞内，再将孵化有探针的细胞与Al3+孵化，使探针与Al3+在细胞内结合生成能发射特征波长荧光的探针-Al3+配合物，实现探针对细胞内离子染色成像，用荧光倒置显微镜观测孵化后的活性细胞荧光像；具体包括以下步骤：(1)细胞培养：活性细胞经复苏接种于含10％胎牛血清以及含1％双抗的1640培养基中，在温度为37℃，5％CO2及饱和湿度为100％的培养箱中培养，每隔2-3天传代1次，选择生长状态良好的细胞接种于12孔板中培养，密度为2×104个/ml，次日用新鲜培养基清洗细胞；(2)探针对细胞孵育：将步骤(1)的细胞中加入含10～40μM探针的培养液中，培养液的组成为90％培养基，8％H2O，2％乙腈，培养箱内孵育20～60min，吸出含探针的培养液，用新鲜的培养基清洗细胞，置于荧光倒置显微镜下分别进行场亮场和暗场拍照，明场下观察到细胞清晰的图像，暗场下没有观察到细胞图像；(3)Al3+对细胞染色：在步骤(2)的细胞中加入含50～120μMAl3+的培养液，培养液的组成为90％培养基和10％H2O，培养箱内孵育20～60min，吸出含Al3+的培养液，用新鲜的培养基清洗细胞，置于荧光倒置显微镜的绿色通道下观察探针对细胞内Al3+染色后的荧光像，细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾晞，廖贤，方浚安，牟兰，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52