一种基于核酸适配体的双荧光探针的制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种基于硅纳米微球与核酸适配体的双荧光探针及其制备方法和应用。该探针的制备过程是，先在硅纳米微球表面修饰与不同靶标分析物的核酸适配体碱基序列互补的两种DNA单链，并在两种核酸适配体链的5’端修饰两种不同的荧光基团，然后将两者混合孵育，基于碱基互补配对的原理，得到双荧光探针。当该探针与靶标分析物共存时，靶标分析物会与核酸适配体竞争结合，从而使核酸适配体与其互补链解链并从探针上脱离下来。将溶液高速离心后，收集上清液并测定荧光强度值，根据两个最大波长处的荧光强度值计算得到各靶标分析物的浓度。本发明专利技术所述双荧光探针可实现复杂样品中两种靶标分析物的同时识别及检测，且操作简便、速度快、灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】
一种基于硅纳米微球与核酸适配体的双荧光探针及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种基于硅纳米微球与核酸适配体的双荧光探针及其制备方法和应用，具体涉及一种同时实现两种靶标分析物高灵敏度检测的双荧光探针的制备方法。
技术介绍
生物传感技术作为分析化学学科中的新型分析技术，具有灵敏度高、专一性好、准确度高、成本低廉、分析速度快以及易于自动化监测等优点，广泛的应用于生命科学，生物医学，食品等领域。纳米硅材料(SilicaMaterialsforMedicalApplication,OpenBiomedEngJ.2008;2:1–9.)具有高的比表面积和大的孔容，且表面易化学修饰，因此在生物医学领域的应用价值越来越受到人们的重视。核酸适配体是由20~60个碱基所组成的、能够特异性识别目标分析物的RNA或单链DNA片段(Aptamer-basedfluorescentbiosensors,CurrMedChem.2011;18:4175-4184.)，可在体外通过指数级富集配体系统进化技术筛选出来，具有可与特异的目标分析物（如：凝血酶，溶菌酶，ATP等）高效、专一结合等特点，并易于修饰和功能化。近年来被广泛应用于传感探针的制备，实现生物样品高灵敏度、高选择性传感与识别领域（DNA-TemplatedAptamerProbeforIdentificationofTargetProteins.AnalChem.2017;89(7):4071-4076.）。提高探针对复杂样品中多种目标分析物的高灵敏度识别与检测，可以显著降低检测成本，提高检测效率，对于环境污染监测、临床医学等领域具有重要的意义。
技术实现思路
针对复杂样品中多种目标分析物同时检测所存在的困难，本专利技术旨在提供一种基于硅纳米微球与核酸适配体的双荧光探针，可同时检测两种靶标分析物，该探针的特异选择性好、检测灵敏度高、检出限低。本专利技术还提供了该双荧光探针的制备方法和应用。本专利技术提供了一种基于硅纳米微球和核酸适配体的双荧光探针的制备方法，在该双荧光探针的制备过程中，先在溶菌酶和凝血酶各自的核酸适配体链的5’端分别修饰不同的荧光基团CdTeQDs（λem=545nm）及染料Cy5（λem=660nm），然后在硅纳米微球表面修饰与两种核酸适配体的碱基序列互补的两种DNA单链，再将修饰有荧光基团的核酸适配体溶液与硅纳米微球溶液混合，由于碱基互补配对，即形成基于硅纳米微球及核酸适配体的双荧光探针。上述制备方法，具体包括以下步骤：①硅纳米微球的制备：将20~50μL的四乙氧基硅烷溶于10~20mL的乙醇中，在2000~3000rpm转速的搅拌下，依次加入水10~20mL、乙醇5~10mL、氢氧化胺0.2~0.4mL的混合溶液，混合物室温搅拌2小时，所得纳米微球溶液用乙醇和水离心超声洗涤；所得沉淀中加入溶有10~30μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液5~10mL，混合物室温继续反应4小时，所得硅纳米微球用乙醇离心洗涤后40℃烘干24h；②将两种不同靶标分析物的核酸适配体互补DNA单链修饰在硅纳米微球表面：将上述洗涤后的硅纳米微球溶于硼酸缓冲液和NaCl的混合液中，得到浓度为30-50mg/mL的硅纳米微球溶液；先加入3’端修饰有羧基的凝血酶的核酸适配体互补的DNA单链（50~150nM，10~50μL），混合溶液中加入N-羟基丁二酰亚胺（NHS）溶液（0.5~1.0mg/mL，20~100μL），反应30-50min后，高速离心，取上层清液测定紫外吸光度值，根据互补DNA单链的原始吸光度值及离心后上清液的吸光度值，可计算出与凝血酶的核酸适配体互补的DNA链接枝量；再向上述硅纳米微球溶液中加入3’端修饰有羧基的溶菌酶适配体互补DNA单链（50~150nM，10~50μL），混合溶液中加入NHS溶液（0.5~1.0mg/mL，20~100μL），反应30-50min后，高速离心15min，取上层清液测定紫外吸光度值，可计算出与溶菌酶的核酸适配体互补的DNA链接枝量；最后将该修饰有凝血酶及溶菌酶的核酸适配体互补DNA单链的硅纳米微球，用硼酸缓冲液和二次水洗涤后，重新溶于二次水中待用；其中，硼酸缓冲液的PH=8.5；离心速度为8000~10000rpm；③基于核酸适配体的双荧光探针的制备：固定有两种核酸适配体互补DNA单链的硅纳米微球溶解于杂化缓冲液中，得到的溶液中硅纳米微球浓度为100~200mg/mL，先加入5’端修饰Cy5的凝血酶适配体（20~100nM），在室温下振荡反应0.5~2小时后，再加入5’端修饰CdTeQDs的溶菌酶适配体（20~100nM），在室温下振荡反应0.5~2小时，离心后，取沉淀重新溶于水，即得基于硅纳米微球球与核酸适配体的双荧光探针；上述制备方法，所述步骤①硅纳米微球的制备中，四乙氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷、无水乙醇及水的体积比为1~2.5：0.5~1.5：500~1000：1000~2000，氢氧化胺和水的体积比为1~2：50~100，混合物先在室温下反应10-15h，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷后，再在室温下反应1-2h，所得硅纳米微球的粒径为40nm-150nm。上述制备方法，所述步骤②中，将凝血酶及溶菌酶的核酸适配体互补DNA单链修饰在硅纳米微球表面，硼酸缓冲液和NaCl的体积比为0.5~1：1，加入的凝血酶适配体互补DNA单链（50~100nM）与溶菌酶适配体互补DNA单链（50~100nM）的体积比为1：1，混合后室温放置时间为10-15h。上述制备方法，所述步骤③中，凝血酶与溶菌酶的核酸适配体分别与硅纳米微球上的互补DNA单链互补配对时，将硅纳米微球溶解在杂化缓冲液中，所述杂化缓冲液由NaCl和柠檬酸钠组成，该杂化缓冲液中NaCl（750mM）、柠檬酸钠（75mM）体积比为1~20：10~50，杂化缓冲液的pH为8.0-8.5，修饰有荧光基团的凝血酶及溶菌酶的核酸适配体的体积比为1：1，在室温下震荡反应1h-4h。本专利技术提供了一种上述制备方法制备出的基于硅纳米微球和核酸适配体的双荧光探针。本专利技术提供了上述基于硅纳米微球和核酸适配体的双荧光探针在同时测定实际样品中两种靶标分析物（如凝血酶及溶菌酶）的浓度中的应用，其中靶标分析物种类包含但不局限于凝血酶及溶菌酶。所述的应用，在实现混合样品中凝血酶、溶菌酶两者各自的浓度测定时，先将该双荧光探针溶于缓冲液中（50~100mg/mL），再加入凝血酶、溶菌酶或两者共存的待测样品溶液，混合物在40-50℃下放置15-45min后，离心收集上清液，并测定λem=545nm及λem=660nm处的荧光强度，并代入已建立的凝血酶及溶菌酶的标准工作曲线，根据荧光强度与凝血酶、溶菌酶的浓度成正比的关系，计算得到混合样品中凝血酶或溶菌酶的浓度，其中所用缓冲液为300mMNaCl、20mMtris-HCl、0.1%Tween20、pH8.3的混合溶液，该荧光探针检测凝血酶及溶菌酶的线性范围分别为0.02~30nM及0.05~40nM。本专利技术的有益效果：1）该双荧光传感探针的制备过程简单、条件温和，检测速度快、灵敏度高、检出限低。2）本专利技术所制备的双荧光探针可实现复杂样品中两种或多种靶标分析物的同时识别及检本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于硅纳米微球和核酸适配体的双荧光探针的制备方法，其特征在于：在该双荧光探针的制备过程中，先在溶菌酶和凝血酶各自的核酸适配体链的5’端分别修饰不同的荧光基团CdTe QDs及染料Cy5，然后在硅纳米微球表面修饰与两种核酸适配体的碱基序列互补的两种DNA单链，再将修饰有荧光基团的核酸适配体溶液与硅纳米微球溶液混合，由于碱基互补配对，即形成基于硅纳米微球及核酸适配体的双荧光探针。

【技术特征摘要】
1.一种基于硅纳米微球和核酸适配体的双荧光探针的制备方法，其特征在于：在该双荧光探针的制备过程中，先在溶菌酶和凝血酶各自的核酸适配体链的5’端分别修饰不同的荧光基团CdTeQDs及染料Cy5，然后在硅纳米微球表面修饰与两种核酸适配体的碱基序列互补的两种DNA单链，再将修饰有荧光基团的核酸适配体溶液与硅纳米微球溶液混合，由于碱基互补配对，即形成基于硅纳米微球及核酸适配体的双荧光探针。2.根据权利要求1所述的基于硅纳米微球和核酸适配体的双荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：①硅纳米微球的制备：将四乙氧基硅烷溶于乙醇中，在剧烈搅拌下，逐滴加入水、乙醇、氢氧化胺的混合溶液，经室温搅拌后，所得纳米微球溶液用乙醇和水离心超声洗涤；所得沉淀中加入溶有3-氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液，混合物室温继续反应，所得硅纳米微球用乙醇离心洗涤；②将两种不同靶标分析物的核酸适配体互补DNA链修饰到硅纳米微球表面：将上述洗涤后的硅纳米微球溶于硼酸缓冲液和NaCl的混合液中，先加入3’端修饰有羧基的凝血酶核酸适配体互补的DNA单链，混合溶液中加入NHS溶液，反应30-50min后，高速离心，取上层清液测定紫外吸光度值，根据互补DNA单链的原始吸光度值及离心后上清液的吸光度值，计算出与凝血酶的核酸适配体互补的DNA链接枝量；再向上述硅纳米微球溶液中加入3’端修饰有羧基的溶菌酶适配体互补DNA单链，混合溶液中加入NHS溶液，反应30-50min后，高速离心15min，取上层清液测定紫外吸光度值，计算出与溶菌酶的核酸适配体互补的DNA链接枝量；最后将该修饰有凝血酶及溶菌酶的核酸适配体互补DNA单链的硅纳米微球，用硼酸缓冲液和二次水洗涤后，重新溶于二次水中待用；③基于核酸适配体的双荧光纳米微球的制备：固定有两种核酸适配体互补DNA单链的硅纳米微球溶解于杂化缓冲液中，先加入5’端修饰Cy5的凝血酶适配体，在室温下振荡反应后，再加入链端修饰QDs的溶菌酶适配体，在室温下振荡反应，离心后，取沉淀重新溶于水，即得基于硅球与核酸适配体的双荧光纳米微球。3.根据权利要求2所述的基于硅纳米微球和核酸适配体的双荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：①硅纳米微球的制备：将20~50μL的四乙氧基硅烷溶于10~20mL的乙醇中，在2000~3000rpm转速的搅拌下，依次加入水10~20mL、乙醇5~10mL、氢氧化胺0.2~0.4mL的混合溶液，混合物室温搅拌2小时，所得纳米微球溶液用乙醇和水离心超声洗涤；所得沉淀中加入溶有10~30μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液5~10mL，混合物室温继续反应4小时，所得硅纳米微球用乙醇离心洗涤后40℃烘干24h；②将两种不同靶标分析物的核酸适配体互补DNA单链修饰在硅纳米微球表面：将上述洗涤后的硅纳米微球溶于硼酸缓冲液和NaCl的混合液中，得到浓度为30-50mg/mL的硅纳米微球溶液；先加入3’端修饰有羧基的凝血酶的核酸适配体互补的DNA单链10~50μL，混合溶液中加入N-羟基丁二酰亚胺溶液20~100μL，反应30-50min后，高速离心，取上层清液测定紫外吸光度值，根据互补DNA单链的原始吸光度值及离心后上清液的吸光度值，计算出与凝血酶的核酸适配体互补的DNA链接枝量；再向上述硅纳米微球溶液中加入3’端修饰有羧基的溶菌酶适配体互补DNA单链10~50μL，混合溶液中加入NHS溶液20~100μL，反应30-50min后，高速离心15min，取上层清液测定紫外吸光度值，可计算出与溶菌酶的核酸适配体互补的DNA链接枝量；最后将该修饰有凝血酶及溶菌酶的核酸适配体互补DNA单链的硅纳米微球，用硼酸缓冲液和二次水洗涤后，重新溶于二次水中待用；其中，3’端修饰有羧基的凝血...

【专利技术属性】
技术研发人员：王艳芹，武晓刚，王景辉，武晓红，陈维毅，王颖，薛雅楠，李爽然，张雪慧，
申请(专利权)人：太原理工大学，
类型：发明
国别省市：山西,14