检测细胞内标靶的颗粒制造技术

本发明专利技术提供了描述用结合部分修饰的纳米颗粒的用途的方法。

【技术实现步骤摘要】
检测细胞内标靶的颗粒分案说明本申请为申请日为2008年2月11日、申请号为200880011218.X、专利技术名称为“检测细胞内标靶的颗粒”的专利申请的分案申请。资助公开本专利技术由政府支持，资助来自Cancer Center for NanotechnologyExcellence (NCI/CCNE)奖励的资金 IU54_CA119341、NIH Director’s Pioneer Award 奖励的资金roP10D000285，和NSEC奖励的资金EEC-0647560。政府对本专利技术具有一定权利。
本专利技术涉及使用纳米颗粒检测细胞内标靶分子浓度的方法，其中所述纳米颗粒包括可以特异性连接标靶分子的结合部分，且其中所述连接导致在连接标靶分子后可检测标靶中可测定的变化。
技术介绍
标记的寡核苷酸广泛地用作检测特异性大分子标靶如核酸和蛋白质的探针。它们与标靶高特异性结合的能力使得它们可以用在体外分析如聚合酶链式反应(PCR)方法中。然而，将这些类型的标靶特异性探针递送进入活细胞存在很大挑战，因为细胞对核酸摄入具有天生的抗性，且包含除去这些外源遗传物质的多种途经。因此，人们对将这些物质以保持其特异性结合性质和荧光信号转导能力的方式递送进入细胞的方法很感兴趣。寡核苷酸-纳米颗粒缀合物的发现和随后的发展为分子诊断学(Elghanian等，1997，Sciencelll:1078-1081 ;Nam 等，2003，Science308:1884-1886)和材料设计(Mirkin 等，1996，Nature382:607_609 ;Alivisatos 等，1996，Nature382:609-611 ;Demers 等，2003，Angew.Chem.1nt.Ed.40:3071-3073)提供了多种新的机会。最近，已经表明寡核苷酸功能化的纳米颗粒进入细胞并起到控制基因表达的反义试剂的作用(Rosi等，2006，Science312:1027-1030)。这些“反义颗粒”不是简单的递送载体(Sandhu 等，2002，Bioconjugate Chem.13:3-6 ;Tkachenko 等，2003，J.Am.Chem.Soc.125:4700-4701)，而是单个实体调节和转染试剂，所述试剂经历细胞内在化，抵抗酶促降低并以比游离寡核苷酸大两个数量级的亲和常数结合细胞内标靶(Lytton-Jean和Mirkin, 2005, J.Am.Chem.Soc.127:12754-12755)。此外，它们可以很容易地被强力的(即高度稳定的)标记材料如锁核酸修饰(Seferos等，2007，ChemBioChem8:1230-1232)且在基因调节所需的条件下没有毒性。实际上，已经显示出，与溶液中缺少寡核苷酸不同，寡核苷酸修饰的金纳米颗粒容易大量被细胞吸收。此性质导致发现可将寡核苷酸修饰的金纳米颗粒用作细胞内基因控制的试剂，在此处它们提供DNA的快速细胞内递送，且还增加细胞中基于协同性质的寡核苷酸的功效。这些寡核苷酸功能化的纳米颗粒已经显示出进入各种细胞类型，且可以用来引入寡核苷酸的高局部浓度。以前也显出与DNA致密功能化的金纳米颗粒以高度协同方式结合互补DNA，导致结合强度比未与金纳米颗粒连接的类似DNA链的所测结合强度高两个数量级。除上述那些用途之外，此性质使得纳米颗粒对DNA和蛋白质诊断分析特别有用。一类感兴趣的寡核苷酸是可以检测具有识别序列的特异性标靶的那些寡核苷酸。医学诊断、药物开发和发育和分子生物学应用对这些结构类型(如果将其引入活细胞)特别感兴趣。然而，目前的递送/转染策略缺少其用途所需的特征，如I)低毒性，2)高细胞摄入，和3)提供对引起假阳性信号的酶的抗性。显像并检测细胞内RNA的探针包括原位染色中所用的那些(Femino等,Science280:585-590, 1998 ；Kloosterman 等，Nat.Methods3:27-29，2006)、分子信标(Tyagi 等，1996，Nat.Biotechnol.14:303-308 ;Sokol 等，1998，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA95:11538-11543；Peng 等，2005，Cancer Res.65:1909-1917 ；Perlette等，2001，Anal.Chem.73:5544-5550 ；Nitin 等，2004，Nucleic Acids Res.32: e58)、和 FRET对(Santangelo 等，2004，Nucleic Acids Res.32:e57 ;Bratu 等，2003，Proc.Natl Acad.Sc1.USAlOO: 13308-13313)，每个都是测定和定量活体系应答外部刺激活性的重要生物学工具(Santangelo 等，2006，Annals of Biomedical Engineering34:39-50)。然而，已经证明将基于寡核苷酸的报道物递送进入细胞基质和细胞是对细胞内检测的巨大挑战。基于寡核苷酸的探针的细胞内在化通常需要转染试剂如脂类(Zabner等，1995，J.Bi0.Chem.270:18997-19007)或树枝状化合物(Kukowska-Latal1 等,1996, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA93:4897-4902)，其可以是有毒的或改变细胞过程。此外，寡核苷酸易于在细胞内降解(Opalinska 和 Gewirtz, 2002，Nat.Rev.Drug Disc.1:503-514),且在突光团标记的探针的情况中，这可以引起无法区别于真正识别事件的高背景信号(Li等，2004，Nucleic AcidsRes.28:e52 ;Rizzo 等，2002，Molecular and Cellular Probesl6:277-283)。因此，虽然已经设计出可以以高特异性识别标靶的纳米颗粒，但是很难检测源自特异相互作用的阳性作用，特别是以高灵敏度在单细胞水平上检测此相互作用。 因此本领域需要开发能够进入细胞去连接特异标靶的材料和检测并定量得到细胞内相互作用的方法。
技术实现思路
本专利技术提供了测定细胞内标靶分子浓度的方法，包括在允许标靶分子与纳米颗粒连接的条件下使标靶分子接触纳米颗粒的步骤，所述纳米颗粒包含特异于所述标靶分子的结合部分，所述结合部分标记有标记物，其中标靶分子和纳米颗粒的连接导致标记物中可检测的变化，且其中可检测标记物中的变化与细胞内所述标靶分子的浓度成比例。在此方法的一个实施方案中，结合部分是多核苷酸，且在另一方面，结合部分是多肽。在结合部分是多核苷酸的实施方案中，其它方面包括其中结合部分是DNA分子或RNA分子的那些方面。在此方法的其它实施方案中，标靶分子是多核苷酸或多肽。在标靶分子是多核苷酸的实施方案中，其它方面包括其中结合部分是DNA分子或RNA分子的那些方面。在一个实施方案中，本专利技术提供了方法，其中结合部分是与纳米颗粒共价连接的多核苷酸，且标记物是连接与结合部分多核苷酸杂交的多核苷酸的标记，其中结合部分多核苷酸和标靶分子的连接释放出杂交的多核苷酸，且释放后标记物是可检测的。一方面，标记物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种测定标靶分子的细胞内浓度的方法，包括将标靶分子与纳米颗粒在允许所述标靶分子与所述纳米颗粒连接的条件下接触的步骤，所述纳米颗粒包含特异于所述标靶分子的结合部分，所述结合部分用标记物标记，其中所述标靶分子和所述纳米颗粒的连接导致标记物的可检测的改变，而且其中所述可检测的标记物的改变与所述标靶分子的分子内的浓度成比例。2.如权利要求1所述的方法，其中所述结合部分选自由多核苷酸和多肽组成的组中。3.如权利要求2所述的方法，其中所述结合部分是DNA。4.如权利要求2所述的方法，其中所述结合部分是RNA。5.如权利要求1所述的方法，其中所述标靶分子选自由多核苷酸和多肽组成的组中。6.如权利要求2所述的方法，其中所述结合部分为共价连接到所述纳米颗粒的多核苷酸，而且所述标记物为连接到与所述结合部分多核苷酸杂交的多核苷酸的标记，其中所述结合部分多核苷酸与所述标靶分子的连接释放所述杂交的多核苷酸，而且在释放之后，能够检测到所述标记物。7....

【专利技术属性】
技术研发人员：查德·A·米尔金，德怀特·塞费罗斯，大卫·A·吉廖翰，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：