【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法
本专利技术涉及植物分子生物学领域，特别是涉及一种快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法。
技术介绍
内参基因，也被称作参照基因或者管家基因，是研究目的基因表达量变化的重要内源对照。内参基因表达量的不稳定和变化将导致需要研究的目的基因的表达量的偏差和波动，为了获得精确和可信度高的实验结果，鉴定和评价合适的内参基因是任何一个物种进行基因表达分析的关键前提条件。近几年随着测序技术的快速发展和测序成本的不断降低，科学家完成大量植物物种的全基因测序工作，在这些已获得基因组信息的植物物种内开展内参基因适用性的研究，成为从各方面深入研究该植物物种的基础。目前有许多植物物种需要对内参基因在不同组织、不同发育阶段、不同的环境处理条件下的适用性进行研究。鉴定和评价内参基因的适用性，需要对其稳定性进行排序，技术操作基于实时性光定量PCR，目前应用最广泛的用于基因表达量分析的技术手之一，其具有较高的稳定性、特异性和可靠性。胡杨(Populus euphratica Oliv)生长在干旱盐碱和温差剧烈变化的极端沙漠环境中，被国际学术界越来...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)确定目标植物种类和目标基因，并目标植物其进行前处理，提取目标植物的总RNA，反转录为cDNA作为PCR的为模板，选择多个在其它物种中常用的并在转录组中表达较稳定的多个内参基因，所述内参基因的数量大于等于9，设计特异性引物，进行实时荧光定量PCR反应，得到CT值； (2)将所述CT值数据通过geNorm、NormFinder>BestKeeper三种软件分析其适用性，然后用R软件的RankAggreg程序包，将每个处理里得到的四组适用性排序数据进行加权平均聚合，得到所述多个基因的最终适用性排序。2.根据权利要求1所述的快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法，其特征在于:所述目标植物为草本粮食作物或木本植物，所述前处理为环境胁迫处理，为脱落酸处理、寒冷处理、脱水处理、干旱处理、短期盐胁迫处理或长期盐胁迫处理中的一种或几种。3.根据权利要求2所述的快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法，其特征在于:所述目标植物为水稻、小麦、玉米、大豆、杨树、松树、柏树、杉木、苹果树、梨树、葡萄、橙子。4.根据权利要求3所述的快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法，其特征在于:所述目标植物为胡杨。5.根据权利要求1所述的快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法，其特征在于:所述步骤(1)具体为:确定目标植物为胡杨，对胡杨进行前处理，用CTAB法氯仿抽提提取胡杨叶片的总RNA，从拟南芥、水稻研究中找到常用来作为内参基因的基因，以及已有的胡杨的转录组数据中，共挑出16个候选的内参基因，分别为18S、60S、Actin, Cpn60 β、EFla、eIF-5A、GAPDH、GII a、HIS、LIPL、LTP、RA、RP、RPL17、TUB 和 UBQ,以及三个用于检测内参基因适用性的三个目标基因PePYLl、PeSCOF-1和PeSCL7，对每个所述目标基因用Primer6软件设计特异性引物，对16个候选内参基因进行实时荧光定量分析，20ul的反应体系含有IOul SuperReal PreMix Plus, Iul 的 sscDNA,对应约 9ng 的 RNA, 2ul 的 ROX referenceDye，上下游各0.3uM的引物，反应条件为 95°C 5min，95°C 15s60°C 60s共40个循环，然后温度由40°C到100°C升温，每个温度下记录荧光值来获得溶解曲线，其中重复数为3，得到CT值。6.根据权利要求5所述的快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法，其特征在于:所述前处理包括如下步骤: 在每年的四月份取来自新疆维吾尔族自治区的胡杨仔苗，四月上旬种植于直径60cm高50cm的圆盆内，每盆3-5棵，土壤以沙土为主，含有少量蛭石和花卉营养土，每周浇两次水，待小苗生长3-4个月，即七月初或月末，苗高60~80cm的时候进行环境胁迫处理，所述环境胁迫处理方法为以下方法中的一种或几种: A、脱落酸处理:对胡杨小苗叶面喷洒200mMABA溶液，溶液由ABA固体粉末配制而成，处理时间为...
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