本发明专利技术提供了一株壳聚糖酶产生菌——Mitsuaria?sp.GD02-M41及其应用，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮政编码：430072，保藏日期：2014年3月19日，保藏编号：CCTCC?No：M2014095。本发明专利技术经筛选诱变获得的一株壳聚糖酶产生菌——Mitsuaria?sp.GD02-M41产生的壳聚糖酶为内切酶，酶解壳聚糖后不产生氨基葡萄糖，相比于化学水解方式，能在更短时间内获得壳寡糖，且无污染、条件温和，具有良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一株壳聚糖酶产生菌及其应用(一)
本专利技术涉及一株壳聚糖酶产生菌——Mitsuaria sp.⑶02-M41，及其在微生物酶解壳聚糖制备壳寡糖中的应用。(二)
技术介绍
壳聚糖(Chitosan)为几丁质脱乙酰化后的产物，溶解性能较几丁质有很大提高，具有良好生物相容性。壳寡糖(Chito-oligosaccharide) —般是指2~10个聚合度的低糖，可通过壳聚糖水解制得，具有较低的分子量，呈水溶性，非常容易被人体吸收，作为一种功能性低聚糖，具有抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、调节人体免疫及抗癌等功效，在医药、食品等领域中具有广泛的应用前景。目前制备壳寡糖的方法主要有化学降解法和酶解法，采用化学法降解寡糖得率低，产物分离困难，而且对环境污染严重。酶解法则具有反应条件温和，寡糖得率高，不造成环境污染等优点。壳聚糖水解酶主要有壳聚糖酶、N-乙酰葡萄糖胺酶以及非专一性水解酶等。壳聚糖酶是壳聚糖的专一性水解酶，能特异性将壳聚糖水解成聚合度为2~8的壳寡糖，是制备壳寡糖的主要研究方向。壳聚糖具有广谱抗菌性，而且对人体无毒无副作用，不同分子量的壳聚糖的抗菌性能有所差异。如 管云林等采用Staphylococcus aureus作为试验菌株,发现随壳聚糖的分子量降低抗菌性能增强，并由此提出了壳聚糖抗菌的两个模型。夏文水等采用Escherichiacoli作为试验菌株，发现随分子量上升抑制菌效果逐渐下降，而且通过试验测定分子量为1500的壳寡糖抑菌效果最强。Keisuke U等报道平均分子量小于5000的壳聚糖对Staphylococcus aureus和Escherichia coli不仅没有抗菌作用，反而能促进细菌的生长，而分子量约9300的壳聚糖几乎可以完全抑制细菌生长。Yousook等报道分子量为4万的壳聚糖在浓度为 0.5% 时,对 Staphylococcus aureus 和 Escherichia coli 的杀灭率为 90%，分子量为18万的壳聚糖在浓度为500ppm时，对Staphylococcus aureus和Escherichiacoli的杀菌率几乎为100%。杨玉红曾报道相对分子质量分别为500、2100、3700、5200、9000的壳寡糖对Escherichia coli的抑制作用，发现相对分子质量2100的壳寡糖对大肠杆菌抗菌作用最强，其抑菌作用随壳寡糖质量浓度的增加而增强。(三)
技术实现思路
专利技术目的是提供经筛选诱变获得的一株壳聚糖酶产生菌一Mitsuariasp.GD02-M41，及其在微生物酶解壳聚糖制备壳寡糖中的应用。本专利技术采用的技术方案是:一株壳聚糖酶产生菌——Mitsuaria sp.⑶02-M41，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国，武汉，武汉大学，邮政编码:430072，保藏日期:2014年3月19日，保藏编号:CCTCC No:M2014095o本专利技术筛选到一株产壳聚糖酶菌株，对该菌株进行紫外诱变育种，经补料发酵培养，壳聚糖酶产量最大达4.86U/ml，并研究了采用该菌株产生的壳聚糖酶制备壳寡糖的可能性，测定了壳聚糖不同酶解时间产物的平均聚合度和分子量，考察了壳寡糖对大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的抗菌性能,为专一'I"生酶促生产壳寡糖打下基础。本专利技术还涉及所述的Mitsuaria sp.⑶02-M41在微生物酶解壳聚糖制备壳寡糖中的应用。本专利技术的有益效果主要体现在:本专利技术经筛选诱变获得的一株壳聚糖酶产生菌——Mitsuaria sp.⑶02-M41产生的壳聚糖酶为内切酶，酶解壳聚糖后不产生氨基葡萄糖，相比于化学水解方式，能在更短时间内获得壳寡糖，且无污染、条件温和，具有良好的应用前景。(四)【专利附图】【附图说明】图1为Mitsuaria sp.⑶02的系统发育树；图2为水解时间对壳寡糖完全水解的影响；图3为发酵时间对壳寡糖完全水解的影响；图4为 HCl浓度对壳寡糖完全水解的影响；图5为TLC薄层层析;1，7:氨基葡萄糖标准品；2:酶解5min ；3:酶解IOmin ；4:酶解 20min ；5:酶解 30min ；6:酶解 60min ；图6为壳聚糖/壳寡糖对大肠杆菌生长的影响；图7为壳聚糖/壳寡糖对酵母菌生长的影响；图8为壳聚糖/壳寡糖对金黄色葡萄球菌生长的影响。(五)【具体实施方式】下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此:实施例1:1.材料与方法1.1 试剂壳聚糖(脱乙酰度90.14%，浙江玉环海洋生化有限公司)；盐酸氨基葡萄糖(分析纯，中国医药集团上海试剂公司)；3，5-二硝基水杨酸(化学纯，国药集团化学试剂有限公司)；GF254硅胶板(青岛海洋化工厂)；其他试剂均为分析纯。1.2培养基壳聚糖液体培养基:壳聚糖10g/L，K2HPO4L Og/L, (NH4) 2S042.0g/L, NaH2P042.0g/L, CaCl20.lg/L, MgSO40.5g/L，溶剂为水，ρΗ6.0，110°C灭菌 20min。牛肉膏蛋白胨培养基:3g/L牛肉膏，lOg/L蛋白胨，5g/L NaCl，溶剂为水，pH7.0~7.2，120°C灭菌 20min。胶体壳聚糖:lg壳聚糖中加入3mL的lmol/L HCl,加蒸懼水至IOOmL,调pH至6.5,配成1%的胶体壳聚糖。1.3 方法1.3.1壳聚糖酶产生菌的筛选取采自浙江玉环海洋生化有限公司的废弃虾壳堆积地的土样Ig加入盛有IOmL无菌水的试管中，摇匀后取0.2mL上清液加入到初筛平板中，涂布均匀，在37°C下培养四天。取出观察菌落的生长情况和透明圈大小，取生长良好以及生长圈较大的单菌落，接至胶体壳聚糖平板，培养3天后取出平板，测量各菌落直径(d)和其透明圈的直径(D)，以D/d的比值作为菌株产壳聚糖酶能力的指标。将平板初筛所得的各菌株分别接至装IOOmL胶体壳聚糖液体培养基的250mL三角瓶中，30°C、150rpm培养48h后，取样测定发酵液的酶活力。结合平板筛选的结果，挑取酶活力最高的菌株，观察菌体形态并做进一步鉴定。1.3.2壳聚糖酶活力的测定将1%的壳聚糖溶液与适量酶液混合，在37 °C下反应lOmin，沸水浴5min灭活，加入ImL0.25mol/L NaOH使未降解的壳聚糖沉淀，5000 X g离心10min，去除沉淀，取上清液ImL于新试管中，加入1.5mL DNS和2mL蒸馏水摇匀，沸水浴反应5min取出冷却，测定OD540nm,以氨基葡萄糖为标准品，根据标准曲线计算还原糖含量。一个酶单位定义为在37°C，反应Imin水解产生Iumol还原糖所需的酶量。1.3.3壳聚糖酶产生菌的诱变育种将培养了 48小时的菌液5000Xg，4°C离心10min，用0.85%无菌生理盐水稀释浓度至108个/mL，采用紫外诱变(功率30W，照射距离为35cm)不同时间，将处理后的菌悬液适当稀释后，取上述悬液0.1mL涂布于固体培养基上，30°C避光培养3d，通过计算透明圈直径和菌落直径的比值，初筛出优良菌株。将初筛的优良菌株接种至本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一株壳聚糖酶产生菌——Mitsuaria sp.⑶02-M41，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国，武汉，武汉大学，邮政编码:430072，保藏日期:2...
【专利技术属性】
技术研发人员：邱乐泉，吴石金，钟卫鸿，钟莉，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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