本发明专利技术涉及基因工程【技术领域】，提供了一种基于J亚群禽白血病病毒gag基因保守序列的siRNA重组干扰载体，该载体利用gag基因非常保守这一情况，利用该基因设计合成siRNA，构建形成siRNA的发卡结构，进一步获得退火双链DNA后，将其与载体连接构建重组干扰载体，将该干扰载体与病毒共转染细胞，最终发现本发明专利技术提供的这种干扰载体可有效地干扰体外细胞及活鸡体内J亚群禽白血病病毒的转录与复制，为J亚群禽白血病的防治提供科学基础和技术支撑，降低养禽业因ALV-J感染造成的经济损失。
【技术实现步骤摘要】
—种基于J亚群禽白血病病毒gag基因保守序列的s i RNA重组干扰载体及其制备方法和应用
本专利技术涉及基因工程
，提供了一种基于J亚群禽白血病病毒gag基因保守序列的siRNA重组干扰载体及其制备方法和其在干扰J亚群禽白血病病毒在体外细胞及活鸡体内转录与复制的应用。
技术介绍
J亚群禽白血病是由J亚群禽白血病病毒(ALV-J)引起的一种肿瘤性疾病。ALV-J是具有囊膜的反转录病毒，禽临床感染主要表现为髓细胞瘤、免疫耐受、高死亡率和生长迟缓。1997~1998年间，ALV — J呈全球性爆发，对世界肉种鸡业造成了毁灭性打击。ALV-J感染除引起髓细胞瘤外，成红细胞瘤、血管瘤、肾瘤和肉瘤常在感染后期伴随发生，通常死亡率为1%~5%，高峰期可达50%。研究证实，ALV-J对免疫应答具有持久损害作用，使生产力低下，继发感染和混合感染频发，J亚群禽白血病严重危害养殖业的健康发展。国外通过净化控制本病的发生，由于净化周期长、成本高，在我国目前还未能有效实施，只能通过淘汰感染鸡只进行大群净化，这种方法由于不及时不彻底而无法控制ALV-J的感染；ALV为RNA病毒，其基因组全长约7.6-7.8kb。ALV-J的前病毒基因组主要含有3个结构基因，分别编码病毒结构蛋白、RNA依赖的DNA聚合酶(反转录酶)和囊膜糖蛋白。从5’端至3’端其排列顺序依次为LTR-leader-gag-pol-env-leader-LTR。gag基因非常保守，与A、C、D亚群比较有96%-97%的同源性，主要编码病毒基质蛋白MA(P19)、衣壳蛋白CA(P27)、核衣壳蛋白NA(P15)以及参与env基因转录后加工的蛋白酶PR(P12)，它们都是病毒群特异性抗原，所有 的ALVs都有，与亚群无关；同时ALV - J为囊膜病毒，病毒囊膜决定了病毒的抗原性，而抗原性又不断变动，这成为禽白血病常规疫苗研制无法逾越的瓶颈。基于此，研制抗J亚群禽白血病生物制剂成为目前J亚群禽白血病防控的焦点和热点。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人针对上述现有技术的情况，特别是gag基因非常保守这一情况，利用该基因设计合成siRNA干扰载体，进一步获得退火双链DNA后，将其与病毒共转染细胞，最终发现本专利技术提供的这种干扰载体可有效地干扰体外细胞及活鸡体内J亚群禽白血病病毒转录与复制，为J亚群禽白血病的防治提供科学基础和技术支撑，降低养禽业因ALV-J感染造成的经济损失。专利技术人首先基于gag基因保守序列设计合成了 siRNA，碱基序列为CTGGAGCGCATCACTATTA，其基因序列如序列表SEQ ID NO:1所示；该段序列与靶基因的一段序列相同，是利用siRNA在线设计软件筛选得到；设计可以形成siRNA的发卡结构，并反转录得到ds oligo DNA,连接进干扰载体，载体转染进细胞后，可以转录出其中的编码链，并在细胞内形成发卡结构(链内斜体部分碱基互补，可以形成发卡结构)，在细胞内酶切得到siRNA，siRNA解旋，其反义链与靶基因互补，从而与靶基因结合，使靶基因降解。其作用过程如图1所示； 进而专利技术人利用上述方法将ds oligo DNA连接到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR干扰载体中，最终获得本专利技术所述的这种干扰载体，其中所述的干扰载体购自invitrogen公司；同时专利技术人还公开了上述干扰载体的具体制备方法，如下:基于gag基因保守区域设计合成siRNA ；其具体操作为:对ALV不同亚群及J亚群不同的毒株进行同源性分析，其同源性最高的gag基因中较保守区域片段作为筛选siRNA的序列片段，利用siRNA在线设计软件，得到siRNA，碱基序列为CTGGAGCGCATCACTATTA，其基因序列如序列表SEQ ID NO:1所示；其中专利技术人所选取的毒株包括:NX0101 (ALV-J，DQl 15805)、MQNCSU(ALV-A, DQ365814)、SDAU09E3(ALV-B JF826241)、RSV-Prague(ALV-C,J02342)、RSV-Schmidt-Ruppin D (ALV-D，D I O 652)、SD O 5 O I (ALV-E，EM467236 )、HPRS103(ALV-J, Z46390)and AD0L-7501 (ALV-J, AY027920)。设计合成含上述目的片段的发卡结构，如图3中top strand DNA,其基因序列如序列表SEQ ID NO:2所示,和与之对应的bottom strand DNA,其基因序列如序列表SEQ IDNO:3所示。将其退火形成双链后连接到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR干扰载体中，连接产物转化到感受态细胞DH5a中，涂LB平板(含50 μ g/ml壮观霉素)后，37 °C孵育；转化平板分别挑取3个克隆，摇菌并抽提质粒后进行测序，以验证重组克隆中插入片段序列是否与设计的寡聚单链DNA (也就是top strand DNA和与之对应的bottomstrand DNA)序列一致；通过常规方法的验证发现本专利技术做获得重组载体，重组克隆中插入片段序列与设计的寡聚单链DNA序列一致，进一步专利技术人通过体内和体外检测的方式，证实该重组干扰载体可以有效地干扰体外细胞及活鸡体内J亚群禽白血病病毒转录与复制，一般干扰效率达到80%以上，较之现有的防治手法有着极大的进步，其中所采用的体外检测方法如下:培养DF-1细胞，12h后接毒(ALV-J NX0101毒株)，待细胞状态良好，细胞丰度达到70%-80%时，将DF-1细胞传到24孔板上；待细胞丰度达到70%时(大约8h_12h)，进行重组质粒的转染，72h后通过Real-time PCR检测病毒基因的表达水平、间接免疫荧光检测ALV-J活病毒囊膜蛋白的表达水平、Westernblot检测重组质粒转染DF-1细胞后病毒囊膜蛋白的表达水平以验证干扰效果，蛋白表达结果显示，经干扰后，ALV-J蛋白表达及mRNA转录水平明显降低，干扰效率达到83.8% ； 同样的，体内试验检测:重组干扰质粒与病毒同时接种6日龄鸡胚，同时设ALV-J感染阳性对照组及阴性对照组。雏鸡出壳后，饲养至7周龄，全部剖杀，期间每周进行血液学、组织病理学观察以及病毒学检测抗病毒效果；结果显示重组质粒干扰组鸡生长正常，血液各类白细胞未见明显变化，ALV-J抗原/抗体阴性，无排毒现象，病理组织学检测未见组织损伤及炎症反应。而ALV-J阳性对照组出现严重的病毒血症，排毒，肝脏及心脏等重要器官出现明显的损伤和炎症。实验证明RNA干扰重组载体可达到显著的抗病毒效果。综上所述，本专利技术利用gag基因非常保守这一情况，利用该基因设计合成siRNA干扰载体，并将该干扰载体与病毒共转染细胞，最终发现本专利技术提供的这种干扰载体可有效地干扰体外细胞及活鸡体内J亚群禽白血病病毒转录与复制，为J亚群禽白血病的防治提供科学基础和技术支撑，降低养禽业因ALV-J感染造成的经济损失。【专利附图】【附图说明】图1为本专利技术所涉及的干扰原理图；图2为本专利技术所涉及的干扰载体图谱；图3为本专利技术所设计的top strand DNA和bottom strand DNA的不意图；图中可见top s本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基于J亚群禽白血病病毒gag基因保守序列的SiRNA重组干扰载体，其特征在于:该载体是利用所设计的siRNA，构建其发卡结构，退火后将形成的双链DNA连接到pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR干扰载体中获得的，其中siRNA其基因序列如序列表SEQ ID NO:I所示。2.权利要求1所述的重组干扰载体的制备方法，其特征在于:具体步骤如下: (1)基于gag基因保守区域设计合成siRNA;其具体操作为:对ALV不同亚群及J亚群不同的毒株进行同源性分析，其同源性最高的gag基因中较保守区域片段作为筛选siRNA...
【专利技术属性】
技术研发人员：成子强，魏戎蓉，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：
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