利用两性表面活性剂促进木质纤维素酶解及降温回收纤维素酶的方法技术

本发明专利技术公开了利用两性表面活性剂促进木质纤维素酶解及降温回收纤维素酶的方法。该方法将木质纤维素加入缓冲溶液中，再加入两性表面活性剂和纤维素酶，加热反应，得到木质纤维素的糖化水解液，通过固液分离后得到酶解液体，再降低酶解液体温度使两性表面活性剂和纤维素酶同时沉淀出来进行循环利用。本发明专利技术方法首次提出了利用两性表面活性剂具有临界溶解温度的特性通过简单的降温回收纤维素酶的方法。本发明专利技术方法不仅可以有效地提高木质纤维素的酶解效率，回收一定的纤维素酶，而且操作简单，不需要额外的设备，绿色环保，回收的纤维素酶保留了很高的活性。

Method for promoting lignocellulose hydrolysis and cooling recovery of cellulase by using amphoteric surfactant

The invention discloses a method for promoting lignocellulose hydrolysis and cooling recovery of cellulase by using amphoteric surfactant. The method of lignocellulose adding buffer solution, adding amphoteric surfactant and cellulase, heating reaction, saccharification of lignocellulose hydrolysate obtained by solid-liquid separation, enzymatic hydrolysis and enzymolysis liquid, reduce the temperature of the liquid so that the amphoteric surfactant and cellulose enzyme and precipitation recycling. The present method for the first time proposes a method for recovering cellulase by simple temperature reduction by using the characteristics of amphoteric surfactant having critical solubility temperature. The method of the invention not only can effectively improve the efficiency of enzymatic hydrolysis of lignocellulose, recover the cellulase, and the operation is simple, without the need for additional equipment, environmental protection, recycling of cellulase retained high activity.

【技术实现步骤摘要】
利用两性表面活性剂促进木质纤维素酶解及降温回收纤维素酶的方法
本专利技术涉及木质纤维素酶解
，特别涉及利用两性表面活性剂促进木质纤维素酶解和回收纤维素酶的方法。
技术介绍
木质纤维素生物炼制燃料乙醇是替代汽油有效可行的技术之一。在这一炼制过程中，纤维素酶能否高效酶解木质纤维素底物是关键的技术瓶颈。同时,纤维素酶因其具有活力低、耗量大和价格高等特点,直接阻碍了纤维素乙醇的工业化。实现纤维素酶的高效回收利用是降低生物乙醇成本的重要途径。目前,纤维素酶回收利用技术除了超滤膜回收和新鲜底物重吸附法回收。纤维素酶的固定化也是增加酶的稳定性减少纤维素酶费用的有效办法。研究者们将纤维素酶固定在二氧化矽晶片，二氧化硅，玻璃微珠，海藻酸钙凝胶珠和磁性纳米颗粒上。由于负载的纤维素酶不溶于水，其对可溶性的羧甲基纤维素有较好的水解能力，但是对于真实的木质纤维素底物酶解效率较低。为了让纤维素酶水解效率高且方便回收，具有环境响应(如温度、pH)的智能高分子成了人们研究的对象，由于调节pH过程需要消耗酸和碱，采用具有温度响应的聚合物来回收纤维素酶更加绿色环保，一些非离子聚合物如聚异丙基丙烯酰胺具有灵敏的温度响应性质，将纤维素酶与这些非离子聚合物采用共价键结合在一起，可以使改性后的纤维素酶具有高温析出和低温溶解的性质。通过具有酰胺基的甲基丙烯酰胺与N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)或N-异丙基甲基丙烯酰胺(NIPMa)的共聚合成了两类具有最低临界溶解温度(LCST)的共聚物。实验合成了LCST在20.9-60.5℃范围内的一系列聚合物。将由嗜热菌Pyrococcushorikoshii产生的内切葡聚糖酶通过5-磷酸吡哆醛转氨以产生含酮蛋白质，然后将转氨后的纤维素酶与含有酰胺键的聚合物共聚合成生物缀合物。在两次再循环后内切葡聚糖酶保持了60％以上的活性，并且与单独的未修饰的酶相比可以产生更多的可溶性糖(JournaloftheAmericanChemicalSociety,2013,135:293-300.)。通过N-异丙基甲基丙烯酰胺(NIPMA)与丙烯酸甲酯和N-(羟甲基)丙烯酰胺的聚合而成的热响应聚合物(PNMN)用于与纤维素酶以形成生物缀合物。通过小分子猝灭，调节聚合物(PNMN)的LCST为51.6℃，此时回收率为98.5％，通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺将纤维素酶共价结合到PNMN合成生物缀合物(PNMN-C)，聚合物-纤维素酶生物缀合物在重复5次水解反应循环后依然保持了其初始活性的85.2％(JournalofMolecularCatalysisB:Enzymatic,2016,128:39-45.)。但是温敏性高分子负载纤维素酶仍然面临着一些问题：1、在较高的温度下回收纤维素酶，纤维素酶容易失活；2、将纤维素酶接枝在聚合物上时纤维素酶容易失活，3、纤维素酶是个多组分的酶系，其接枝反应和回收率不尽相同，回收影响酶系的活性。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种能耗少，绿色环保，只需要自然或通过制冷设备降低酶解液体的温度就可以回收纤维素酶的利用两性表面活性剂促进木质纤维素酶解并通过降温来回收纤维素酶的方法。本专利技术两性表面活性剂需要具备适当的临界溶解温度(UCST)，使其在酶解温度下40～60℃完全溶解在缓冲液中，酶解结束后，可以通过降温的方法从酶解液体中沉淀出来。本专利技术的目的通过下述方案实现：利用两性表面活性剂促进木质纤维素酶解及降温回收纤维素酶的方法，包括以下步骤：将木质纤维素加入缓冲溶液中，再加入两性表面活性剂和纤维素酶，加热至40～60℃温度下反应24～96h，得到木质纤维素的糖化水解液，通过固液分离后得到酶解液体，再降低酶解液体温度使两性表面活性剂和纤维素酶同时沉淀出来，进行循环利用；所述两性表面活性剂的UCST为0～40℃。为进一步实现本专利技术目的，优选地，所述两性表面活性剂为氨基酸型两性表面活性剂、甜菜碱型两性表面活性剂、磺基甜菜碱型两性表面活性剂和磷酸酯甜菜碱两性表面活性剂中的至少一种。优选地，所述两性表面活性剂为C8H18(CH3)2N+(CH2)OSO3﹣、C12H26(CH2)2N+CH2PO4﹣、C18H38(CH3)2N+O﹣、C14H30(CH3)2N+(CH2)3SO3﹣、C16H34(CH3)2N+(CH2)3SO3﹣和C8H17P(CH3)2O中至少一种。优选地，通过固液分离得到酶解液体的方法为自然沉降法、倾析法、过滤法、离心法或这些方法的联合使用。优选地，降低酶解液体的温度的方法为自然冷却法或通过制冷设备冷却。优选地，所述缓冲溶液为pH＝4.5～6.2，离子强度为5～200mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲液。优选地，所述木质纤维素为松木、桉木、杨木、水曲柳、沙棘、伯树、杉木、桦木、玉米芯、玉米秸秆、麦秆、甘蔗渣、稻草、稻壳、食用菌基质和花生壳中的至少一种。优选地，所述缓冲液的量为木质纤维素质量的5～50倍。优选地，所述两性表面活性剂与木质纤维素的质量比为10～50：100。优选地，所述纤维素酶的用量以木质纤维素中的葡聚糖含量计为3～30FPU/g。本专利技术的机理为：由于一般的两性表面活性剂都具有临界溶解温度(UCST)，当温度高于UCST时，两性表面活性剂溶解于缓冲液中，减少纤维素酶在木质素上的无效吸附，促进木质纤维素的酶解；当温度低于UCST时，两性表面活性剂析出，由于两性表面活性剂与纤维素酶有一定的疏水作用，所以在两性表面活性剂析出时会将溶液中的纤维素酶一起沉淀下来。本专利技术两性表面活性剂需要具备适当的临界溶解温度(UCST)，使其在酶解温度下(40～60℃)完全溶解在缓冲液中，酶解结束后，可以方便的通过降温的方法从酶解液体中沉淀出来。本专利技术相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：(1)本专利技术以两性表面活性剂作为酶解助剂，对纯纤维素的酶解没有抑制作用，可使木质纤维素的酶解糖化得率提高13.7～72.1％。(2)本专利技术中回收纤维素酶的操作简单，只需要自然或通过制冷设备降低酶解液体的温度就可以回收纤维素酶。(3)本专利技术与目前普遍研究的将纤维素酶固定在非离子聚合物上通过升高温度来回收纤维素酶相比可以避免纤维素酶的高温失活和固定化反应的失活。(4)本专利技术在操作的过程中不需要用到额外的设备，能耗小，绿色环保。附图说明图1为SB3-16在pH4.8(50mM)醋酸钠缓冲液中的溶解度随温度的变化。图2是两性表面活性剂促进木质纤维素酶解和通过降温来回收纤维素酶的工艺流程图，实施例1-6都是按工艺流程图来进行操作，但是操作中没有补加两性表面活性剂和纤维素酶。具体实施方式为更好地理解本专利技术，下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。下列实施例中所用试剂均可从市场购买得到。实施例中的微晶纤维素型号为PH101(购自西格玛奥德里奇)，纤维素酶是目前被广泛使用的CellicCTec2，底物包含有稀酸预处理的桉木(桉木-DA)和酸性亚硫酸法处理过的松木(松木-SPORL)；用到的两性表面活性剂有SB3-16、C8APSO4、C12PPS和C18DAO。水解液中葡萄糖浓度是通过生物传感分析仪(S本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用两性表面活性剂促进木质纤维素酶解及降温回收纤维素酶的方法，其特征在于包括以下步骤：将木质纤维素加入缓冲溶液中，再加入两性表面活性剂和纤维素酶，加热至40～60℃温度下反应24～96h，得到木质纤维素的糖化水解液，通过固液分离后得到酶解液体，再降低酶解液体温度使两性表面活性剂和纤维素酶同时沉淀出来，进行循环利用；所述两性表面活性剂的UCST为0～40℃。

【技术特征摘要】
1.利用两性表面活性剂促进木质纤维素酶解及降温回收纤维素酶的方法，其特征在于包括以下步骤：将木质纤维素加入缓冲溶液中，再加入两性表面活性剂和纤维素酶，加热至40～60℃温度下反应24～96h，得到木质纤维素的糖化水解液，通过固液分离后得到酶解液体，再降低酶解液体温度使两性表面活性剂和纤维素酶同时沉淀出来，进行循环利用；所述两性表面活性剂的UCST为0～40℃。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述两性表面活性剂为氨基酸型两性表面活性剂、甜菜碱型两性表面活性剂、磺基甜菜碱型两性表面活性剂和磷酸酯甜菜碱两性表面活性剂中的至少一种。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述两性表面活性剂为C8H18(CH3)2N+(CH2)OSO3﹣、C12H26(CH2)2N+CH2PO4﹣、C18H38(CH3)2N+O﹣、C14H30(CH3)2N+(CH2)3SO3﹣、C16H34(CH3)2N+(CH2)3SO3﹣和C8H17P(CH3)2O中至少一种。4.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：楼宏铭，蔡诚，邱学青，詹雪娟，杨东杰，庞煜霞，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44