一种菜籽源锌螯合肽及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开一种菜籽源锌螯合肽，所述锌螯合肽的氨基酸序列为：Ala‑Ser‑His；本发明专利技术还公开一种所述的菜籽源锌螯合肽的制备方法，包括：菜籽蛋白制备，菜籽蛋白两步水解，亲和层析，凝胶过滤层析，反相高效液相色谱分离纯化；本发明专利技术还公开了所述的菜籽源锌螯合肽在制备补锌剂中间体上的应用。本发明专利技术所制菜籽源锌螯合肽具有高锌螯合活性，可作为第四代补锌剂的良好中间体，为进一步开发具有高吸收率和高生物学利用率的第四代补锌产品提供理想的载体。

Rapeseed zinc chelate peptide, preparation method and application thereof

The invention discloses a rapeseed source zinc chelating peptide, amino acid sequence of the peptide zinc chelate is: Ala Ser His; including the preparation method, the invention also discloses a source of zinc chelating rapeseed peptide for the preparation of rapeseed protein, two step hydrolysis of rapeseed protein, affinity chromatography, gel filtration chromatography, reversed-phase high performance liquid chromatography separation and purification of rapeseed; source of zinc chelating peptide of the invention also discloses the application in the preparation of zinc on intermediates. The source of zinc chelating rapeseed peptide with high zinc chelating activity, can be used as the fourth generation of zinc agent is good for the further development of intermediate carrier with high absorption rate and high biological provide the ideal with the fourth generation rate of zinc products.

【技术实现步骤摘要】
一种菜籽源锌螯合肽及其制备方法和应用
本专利技术属于油菜籽及其副产物深加工
，具体涉及一种菜籽源锌螯合肽及其制备方法，以及该锌螯合肽在制备补锌产品上的应用。
技术介绍
锌(Zn)是人体必需的微量元素之一，有研究表明，锌是机体内近2000种转录因子的必需组成成分，与超过300种代谢酶的活性有关，影响机体的免疫系统和氧化还原平衡，可作为慢性血管疾病、癌症、神经退行性病变、免疫紊乱和衰老等病理状态下的抗氧化因子和抗炎症因子。锌螯合肽(zincchelatingpeptide，ZCP)是微量金属离子螯合肽中的一种，它是第四代微量元素补充剂中锌离子的配位体，具有Zn2+离子螯合活性，通常由蛋白水解产生的。ZCP能够与Zn2+螯合，用于补充机体的锌元素缺乏症，同时肽金属螯合物也具有抑菌性和抗氧化活性。现有锌螯合肽的来源主要有小麦胚芽(如专利CN103626847B“一种小麦胚芽蛋白源锌螯合肽及其制备方法”)、酪蛋白(如“酪蛋白磷酸肽锌螯合肽的分离及结构性质表征”，中国知网，网址http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20170517.1315.038.html)、榛子(如“榛子螯合肽的制备、分离纯化及性质研究”，中国知网，硕博士论文，网址http：//cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10157-1016143419.htm)、马面鲀鱼皮(如CN104928337A“马面鲀鱼皮锌螯合肽”)、虾仁下脚料(如专利CN105192718A“虾仁下脚料锌螯合肽用途)、单环刺螠(如专利CN106086129A“一种单环刺螠内脏蛋白源锌螯合肽的制备方法”)等，其中，小麦胚芽蛋白源锌螯合肽为10肽和12肽，酪蛋白磷酸肽锌螯合肽为多肽混合物，虾仁下脚料锌螯合肽为8肽，马面鲀鱼皮锌螯合肽为10肽，单环刺螠内脏蛋白源锌螯合肽为5肽；而氨基酸残基大于6肽就很难被人体吸收，除非具有特异性，当被制成补锌食品或保健品后，人体对其中锌离子的吸收率和生物学利用率相当有限。因此，研究开发具有高锌螯合活性的短肽型天然蛋白源锌螯合肽具有十分重要的意义，可为进一步开发具有高吸收率和高生物学利用率的第四代补锌产品提供理想的载体。
技术实现思路
针对现有技术中的问题，本专利技术的目的之一在于提供一种菜籽源锌螯合肽，所述锌螯合肽的氨基酸序列为：Ala-Ser-His(ASH)。本专利技术的另一目的在于提供一种上述菜籽源锌螯合肽的制备方法，该方法包括以下步骤：步骤一：菜籽蛋白制备以菜籽或冷榨菜籽饼为原料，经粉碎处理后得粉末，添加石油醚进行脱脂处理，取过滤后粉渣挥发尽残留石油醚，得脱脂粉渣，再添加乙醇溶液浸泡处理，过滤去除乙醇溶液，最后加入去离子水清洗并过滤，得菜籽蛋白；步骤二：菜籽蛋白两步水解(1)取步骤一所得菜籽蛋白调整其浓度为2～20％(w/v)，pH值1.5～2.0，添加胃蛋白酶，所述胃蛋白酶与所述菜籽蛋白的质量比为0.2～5％，放置于35～40℃反应1.5～2.5h；(2)调节所得水解产物pH值至7.5～8.5，添加胰酶，所述胰酶与所述菜籽蛋白的质量比为0.5～5％，于35～40℃继续反应2～4h，将水解产物浓缩10～50倍，得水解浓缩物；步骤三：亲和层析将所述水解浓缩物上样平衡后的IMAC-Zn2+亲和层析柱，用PBS缓冲液(pH6.8～7.8)冲洗去除未螯合肽，再用含0.05～1.0mol/LNaCl的PBS缓冲液(pH3.0～3.5)进行洗脱，收集获得的螯合组分，冲洗和洗脱流速为0.5～2.0mL/min，检测波长214nm或220nm；将所述洗脱液浓缩10～50倍，得螯合浓缩物；步骤四：凝胶过滤层析将所述螯合浓缩物注入葡聚糖凝胶层析柱进行分离，柱温4～20℃，以蒸馏水为洗脱液，流速0.5～2.0mL/min，检测波长214nm或220nm，收集各凝胶层析组分；步骤五：反相高效液相色谱分离纯化阶段I分离纯化：取锌螯合活性最高的所述凝胶层析组分进行液相色谱分离，流动相A：超纯水，流动相B：甲醇；流速0.8～1.0mL/min，检测波长214nm或220nm；阶段II分离纯化：取阶段I中获得的单一峰组分进行分离纯化，流动相A：0.1％(v/v)TFA水溶液，流动相B：0.1～0.15％(v/v)TFA乙腈溶液；流速0.8～1.0mL/min，检测波长214nm或220nm；取单一峰组分，即得菜籽源锌螯合肽。优选地，步骤一中，按照固液比1∶5～1∶20加入所述石油醚，脱脂处理时间30～60min，重复3～5次；优选地，步骤一中，按照固液比1∶5～1∶20加入所述乙醇溶液，所述浸泡处理时间为2～24h，所述乙醇体积分数为60～95％。优选地，步骤一中，按照固液比1∶5～1∶20加入所述去离子水。优选地，步骤二中，所述胃蛋白酶为30～2400U/mg粉末，所述胰酶为90～1000U/mg粉末。优选地，步骤二中，所述胃蛋白酶和所述胰酶的水解温度为37℃，反应时间分别为2h和4h。优选地，步骤三中，所述IMAC-Zn2+亲和层析柱填料制和预处理方法如下：按固液比1∶3～1∶5，将固定金属亲和层析填料与50mg/mL的ZnCl2溶液混合，在4～30℃下摇动螯合6～36h，得填料；按照固液比1∶3～1∶5，用蒸馏水冲洗去除未螯合锌，再用含0.1MNaCl的20mMPBS缓冲液(pH7.1)冲洗去除非特异性结合锌。优选地，步骤四中，所述葡聚糖凝胶层析柱选自SephadexG25凝胶层析柱。优选地，步骤五中，所述阶段I分离纯化的洗脱条件为：0～30min，流动相B线性从5～8％变为80～90％；洗脱31～33min，流动相B线性为95～100％；34～40min，流动相B线性为5～8％；所述阶段II分离纯化的条件为：0～5min，流动相B线性为5～8％；6～15min，流动相B线性为60～65％；16～20min，流动相B线性为95～100％。本专利技术的又一目的在于提供所述菜籽源锌螯合肽在制备补锌剂中间体上的应用。从以上描述可以看出，本专利技术具备以下优点：本专利技术提供了一种菜籽源新型短肽型锌螯合肽序列(ASH)，该螯合肽以菜籽作为天然蛋白源，采用特殊工艺(模拟人体两步酶解消化——亲和层析——凝胶过滤层析——反相高效液相色谱分阶段分离纯化)制备，突破了现有锌螯合肽生物吸收利用率低的局限性，具有高锌螯合活性，可作为第四代补锌剂的良好中间体，为进一步开发具有高吸收率和高生物学利用率的第四代补锌产品提供理想的载。附图说明图1为实施例3中IMAC-Zn2+亲和层析图谱，其中：I为未螯合组分，II为螯合组分。图2为实施例4中凝胶过滤层析图谱，其中：锌螯合活性大小为II-3＞II-2＞II-1。图3为实施例5中II-3组分的反相高效液相色谱图，其中：洗脱时间8.72min为目标峰。图4为实施例5中目标峰的分离纯化图谱。图5为实施例6中目标峰的一级质谱图。图6为实施例6中目标峰的二级质谱图。图7为实施例6中ASH浓度和锌螯合率的拟合图。具体实施方式下面结合附图，详细说明本专利技术的具体实施例，但不对本专利技术的权利要求做任何限定。实施例1菜籽蛋白的制备称取10g菜籽，用粉碎机处理10min，获得菜籽粉末，然后添加100mL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种菜籽源锌螯合肽，其特征在于：所述锌螯合肽的氨基酸序列为：Ala‑Ser‑His。

【技术特征摘要】
1.一种菜籽源锌螯合肽，其特征在于：所述锌螯合肽的氨基酸序列为：Ala-Ser-His。2.一种权利要求1所述的菜籽源锌螯合肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：步骤一：菜籽蛋白制备以菜籽或冷榨菜籽饼为原料，经粉碎处理后得粉末，添加石油醚进行脱脂处理，取过滤后粉渣挥发尽残留石油醚，得脱脂粉渣，再添加乙醇溶液浸泡处理，过滤去除乙醇溶液，最后加入去离子水清洗并过滤，得菜籽蛋白；步骤二：菜籽蛋白两步水解(1)取步骤一所得菜籽蛋白调整其浓度为2～20％(w/v)，pH值1.5～2.0，添加胃蛋白酶，所述胃蛋白酶与所述菜籽蛋白的质量比为0.2～5％，放置于35～40℃反应1.5～2.5h；(2)调节所得水解产物pH值至7.5～8.5，添加胰酶，所述胰酶与所述菜籽蛋白的质量比为0.5～5％，于35～40℃继续反应2～4h，将水解产物浓缩10～50倍，得水解浓缩物；步骤三：亲和层析将所述水解浓缩物上样进入平衡后的IMAC-Zn2+亲和层析柱，用PBS缓冲液(pH6.8～7.8)冲洗去除未螯合肽，再用含0.05～0.1mol/LNaCl的PBS缓冲液(pH3.5～3.5)进行洗脱，收集获得的螯合组分，冲洗和洗脱流速为0.5～2.0mL/min，检测波长214nm或220nm；将所述洗脱液浓缩10～50倍，得螯合浓缩物；步骤四：凝胶过滤层析将所述螯合浓缩物注入葡聚糖凝胶层析柱进行分离，柱温4～20℃，以蒸馏水为洗脱液，流速0.5～2.0mL/min，检测波长214nm或220nm，收集各凝胶层析组分；步骤五：反相高效液相色谱分离纯化阶段I分离纯化：取锌螯合活性最高的所述凝胶层析组分进行液相色谱分离，流动相A：超纯水，流动相B：甲醇；流速0.8～1.0mL/min，检测波长214nm或220nm；阶段II分离纯化：取阶段I中获得的单一峰组分进行分离纯化，流动相A：0.1％(v/v)TFA水溶液，流动相B：0.1～0.15％(v/v)TFA乙腈溶液；流速0.8～1.0mL/min，检测波...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢宁宁，黄晶晶，鄢嫣，殷俊峰，张福生，余敏，
申请(专利权)人：安徽省农业科学院农产品加工研究所，
类型：发明
国别省市：安徽,34