环介导的级联放大策略用于高灵敏检测DNA甲基转移酶活性制造技术

本发明专利技术公开一种环介导的级联放大策略用于高灵敏检测DNA甲基转移酶活性，基于链置换放大和指数型滚环扩增，设计了一种长茎环探针，其包括用于DNA甲基转移酶识别的甲基化位点、用于确保探针稳定的长茎部和用于引发后续放大的环部。长茎环探针中环部和小部分的茎部作为触发链用于后续的信号输出过程。该触发链被长茎部完全封闭在探针的环部，避免探针泄漏所引起的非特异性放大。长茎环探针被DNA甲基转移酶甲基化，且随后被限制性内切酶切割，产生触发链。在聚合酶和切割酶的协同作用下，所产生的触发链引发链置换放大，产生大量引物。所产生的引物引发指数滚环扩增，合成大量G‑四倍体序列，与染料相互作用而获得增强的荧光信号。

Loop mediated cascade amplification strategy is used for highly sensitive detection of DNA methyltransferase activity

The invention discloses a cascade loop mediated amplification strategy for highly sensitive detection of DNA methyltransferase activity, strand displacement amplification and exponential rolling circle amplification based on the design of a long stem loop probe, including for DNA methylation, methylation enzyme identification is used to ensure that the exploration of long stem needle stability and for the lead ring subsequent amplification. Long stem ring probes with mid and small stems serve as trigger chains for subsequent signal output processes. The trigger chain is completely enclosed in the ring portion of the probe by the long stem to avoid non-specific amplification caused by probe leakage. Long stem ring probes are methylated by DNA methyltransferase and are then cut by restriction enzymes to produce trigger chains. In combination with polymerase and cleavage enzymes, the resulting trigger chain triggers chain substitution amplification and produces a large number of primers. Primers generated by the index caused by rolling circle amplification, the synthesis of G tetraploid sequence, and dye interaction obtained enhanced fluorescence signal.

【技术实现步骤摘要】
环介导的级联放大策略用于高灵敏检测DNA甲基转移酶活性
本专利技术涉及酶活性检测领域，具体涉及一种环介导的级联放大策略用于高灵敏检测DNA甲基转移酶活性的方法。
技术介绍
DNA甲基转移酶是一种表观遗传学修饰酶，在调节基因表达、发育和基因组印记方面起重要作用。其通过在腺嘌呤或胞嘧啶上共价添加甲基而催化DNA甲基化。研究表明DNA甲基转移酶活性异常和疾病的产生和发展有关。显然，DNA甲基转移酶活性被认为是一种潜在的癌症生物标志物和癌症治疗中的药物作用靶点。因此，灵敏检测DNA甲基转移酶活性对于DNA甲基转移酶相关的癌症治疗和诊断至关重要。用于DNA甲基转移酶活性检测的传统方法包括放射性标记法、凝胶电泳和高效液相色谱。为了提高检测的灵敏度和特异性，许多新的方法包括电化学、化学发光、比色和荧光方法已用于DNA甲基转移酶活性检测。在这些方法中，荧光方法作为有力的生物分析工具用于DNA甲基转移酶活性受到广泛的关注。通常情况下，荧光方法通过使用双链探针或含悬垂链的发夹探针用于目标物识别和信号转导。其中，信号转导链被部分地封闭在双链探针或发夹探针茎部。经DNA甲基转移酶识别作用，双链探针或发夹探针本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测DNA甲基转移酶活性或抑制剂药物筛选的长茎环探针，该探针包括c长茎部和环部，其特征是：所述长茎部包括紧靠环部的缓冲区域、DNA甲基转移酶特异性识别位点序列和长茎部区域；其中所述缓冲区域的碱基对为1～7个。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测DNA甲基转移酶活性或抑制剂药物筛选的长茎环探针，该探针包括c长茎部和环部，其特征是：所述长茎部包括紧靠环部的缓冲区域、DNA甲基转移酶特异性识别位点序列和长茎部区域；其中所述缓冲区域的碱基对为1～7个。2.如权利要求1所述的长茎环探针，其特征是：所述环部的序列的碱基数为10～25个；优选的，所述缓冲区域的碱基对为2～5个；进一步优选的，所述缓冲区域的碱基对为3个；优选的，所述长茎部区域的碱基对为18～30个。3.如权利要求1所述的长茎环探针，其特征是：所述长茎环探针的序列为SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7或SEQIDNO:9所示。4.权利要求1～3中任一项所述的长茎环探针在用于检测DNA甲基转移酶活性或在用于筛选DNA甲基转移酶抑制剂/拮抗剂的试剂中的应用。5.一种检测DNA甲基转移酶活性的方法，其特征是，该方法为：当待测样品中存在DNA甲基转移酶时，权利要求1～3中任一项所述的长茎环探针被DNA甲基转移酶甲基化，且随后被甲基化敏感型限制性内切酶特异性地切割，产生触发链；在聚合酶和切割酶的协同作用下，所产生的触发链引发链置换放大反应，产生大量引物；所产生的引物引发指数滚环扩增，合成大量G-四倍体序列；其与染料相互作用而获得增强的荧光信号。6.如权利要求5所述的方法，其特征是，具体包括以下：a、当待测样品中存在DNA甲基转移酶时，所述DNA甲基转移酶特异性识别和催化所述长茎环探针发生甲基化，形成具有甲基化的长茎环；b、甲基化敏感型限制性内切酶将甲基化的长茎环切割成两部分，一部分为双链DNA，另一部分为新发夹探针，所述新发夹探针结构不稳定，发生构象转变成单链DNA形成触发链；c、所述触发链与链置换模板发夹探针杂交，并在链置换扩增活性的聚合酶和切割酶的作用下引发聚合和切割反应，释放出多个引物；d、在DNA连接酶的作用下所释放的引物与挂锁探针杂交得到环状探针；e、所释放的引物在滚环扩增活性的聚合酶作用下触发滚环扩增，合成含多个串联的富含G序列的长DNA产物；f、切割酶切割所述长DNA产物和挂锁探针杂交所形成的双链DNA，产生富含G的序列和所述引物，所述引物继续用于引发下级滚环扩增；g、在金属离子的作用下，富含G的序列折叠成G-四倍体结构，其选择性与染料作用得到增强的荧光信号，即测得DNA甲基转移酶的活性；所述方法为非疾病诊...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜玮，王磊，崔万玲，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37