本发明专利技术公开了一种用于检测黄瓜棒褒叶斑病菌的分子标记及其应用，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。(1)本发明专利技术所述分子标记能够准确、快速、灵敏、实用的检测黄瓜棒孢叶斑病菌；(2)本发明专利技术所述分子标记对病原菌的检测具有灵敏度高的优点，可同时应用于发病植株中黄瓜棒孢叶斑病菌的快速检测。
【技术实现步骤摘要】
一种用于检测黄瓜棒褒叶斑病菌的分子标记及其应用
本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段检测致病菌的方法，具体为一种用于检测黄瓜棒褒叶斑病菌的分子标记及其应用。
技术介绍
多主棒孢是引起黄瓜棒孢叶斑病的病原菌。多主棒孢寄主范围广泛，传播方式多样。近几年经调查发现，由多主棒孢引起的黄瓜、番茄等蔬菜的叶斑病在中国山东、河北、辽宁、内蒙古等11个省市区大面积发生，造成了严重的经济损失。20世纪末，黄瓜棒孢叶斑病在辽宁省瓦房店市爆发，严重危害黄瓜的生产。目前，该病已成为保护地黄瓜的重要叶部病害之一。黄瓜棒孢叶斑病病斑初期为小黄斑，逐渐扩大至近圆形，浅棕色，边缘较薄呈棕色，条件适宜时病斑迅速扩展，边缘呈现水浸状，严重时多个病斑连成片，并可蔓延至叶柄、茎蔓，造成果实流胶，干燥时造成穿孔。黄瓜棒孢叶斑病发生初期症状极易与黄瓜细菌性角斑病和霜霉病混淆，后期不易与炭疽病区分，现阶段缺乏对黄瓜棒孢叶斑病菌的快速检测技术，给田间及时防控造成困难。多主棒孢检测方法包括PCR检测、免疫检测以及彩色图像检测等，并已成功应用于其遗传多样性等方面的研究。现有的免疫检测方法一般以多主棒孢寄主选择性毒素蛋白为抗原制备单克隆抗体，操作较为复杂，实验成本较高。基于计算机彩色图像的检测方法由于拍摄状态和光照等环境因素、发病程度及病斑的典型性不同，均可能对检测准确率产生影响。多主棒孢的PCR检测方法报道较少，现有方法所选用的对照菌株仅3～4株，引物特异性需进一步验证，检测技术尚不完善。同时，已有的黄瓜棒孢叶斑病菌PCR检测方法未能直接将黄瓜棒孢叶斑病菌与黄瓜霜霉病菌、炭疽病菌、细菌性角斑病菌加以区分。因此建立准确、快速、灵敏、实用的黄瓜棒孢叶斑病菌检测方法非常必要。
技术实现思路
本专利技术的目的是：为了克服现有技术的缺陷，建立准确、快速、灵敏、实用的黄瓜棒孢叶斑病菌检测方法，本专利技术提供了一种用于检测黄瓜棒褒叶斑病菌的分子标记及其应用。技术方案：一种用于检测黄瓜棒褒叶斑病菌的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQIDNO.1～2；P2，SEQIDNO.3～4；P3，SEQIDNO.5～6。优选的，所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5，端进行氨基化修饰。表1分子标记序列名称序列(5，-3，)SEQIDNO.P1-FNH2-GCGTGCAAGGCCGGTTTCGC1P1-RGGCGAGTCCTTCTGGCCCAT2P2-FNH2-CGAAGGTGAACATCATAGA3P2-RGAGATTTCCAAAAGGGCAT4P3-FNH2-CGTGCAAGCAGATTACGGT5P3-RGCAGCCCTCATGGATTT6所述的分子标记在制备检测黄瓜棒褒叶斑病菌试剂盒中的应用。优选的，所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。优选的，所述试剂盒检测黄瓜棒褒叶斑病菌的步骤包括：(1)取样：提取黄瓜叶片样品的基因组DNA；(2)以步骤(1)提取的DNA作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释200～500倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释20～100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。优选的，所述甘蔗叶片样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。优选的，所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP2μL、LATaq2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。优选的，所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。优选的，所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。优选的，所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。有益效果：(1)本专利技术所述分子标记能够准确、快速、灵敏、实用的检测黄瓜棒孢叶斑病菌；(2)本专利技术所述分子标记对病原菌的检测具有灵敏度高的优点，可同时应用于发病植株中黄瓜棒孢叶斑病菌的快速检测。附图说明图1是实施例1～3检测结果图；其中，M为分子量为1200bp的Maker；1为实施例1PCR产物电泳结果；2为实施例2PCR产物电泳结果；3为实施例3PCR产物电泳结果。具体实施方式实施例1一种用于检测黄瓜棒褒叶斑病菌的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQIDNO.1～2；P2，SEQIDNO.3～4；P3，SEQIDNO.5～6。所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5，端进行氨基化修饰。所述的分子标记在制备检测黄瓜棒褒叶斑病菌试剂盒中的应用。所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。所述试剂盒检测黄瓜棒褒叶斑病菌的步骤包括：(1)取样：提取黄瓜叶片样品的基因组DNA；(2)以步骤(1)提取的DNA作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释200倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释100倍后作为第三轮PCR的模板，以P3作为特异性引物，进行第三轮PCR扩增；(5)收集第三轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。所述甘蔗叶片样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。所述PCR扩增的体系为25μL：模板2μL、PCR反应缓冲液2.5μL、dNTP2μL、LATaq2μL、分子标记1μL、双蒸水15.5μL。所述第一轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。所述第二轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。所述第三轮PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。实施例2一种用于检测黄瓜棒褒叶斑病菌的分子标记，所述分子标记及其序列为：P1，SEQIDNO.1～2；P2，SEQIDNO.3～4；P3，SEQIDNO.5～6。所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5，端进行氨基化修饰。所述的分子标记在制备检测黄瓜棒褒叶斑病菌试剂盒中的应用。所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。所述试剂盒检测黄瓜棒褒叶斑病菌的步骤包括：(1)取样：提取黄瓜叶片样品的基因组DNA；(2)以步骤(1)提取的DNA作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释400倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释80倍后作为第三轮P本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测黄瓜棒褒叶斑病菌的分子标记，其特征在于，所述分子标记及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4；P3，SEQ ID NO.5～6。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测黄瓜棒褒叶斑病菌的分子标记，其特征在于，所述分子标记及其序列为：P1，SEQIDNO.1～2；P2，SEQIDNO.3～4；P3，SEQIDNO.5～6。2.根据权利要求1所述的一种用于检测黄瓜棒褒叶斑病菌的分子标记，其特征在于，所述分子标记P1、P2和P3的上游引物5’端进行氨基化修饰。3.权利要求1或2所述的分子标记在制备检测黄瓜棒褒叶斑病菌试剂盒中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的组分包括：分子标记、dNTP、LATaq、PCR反应缓冲液、MgCl2、双蒸水。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒检测黄瓜棒褒叶斑病菌的步骤包括：(1)取样：提取黄瓜叶片样品的基因组DNA；(2)以步骤(1)提取的DNA作为PCR模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释200～500倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；(4)取第二轮PCR扩增的产物，稀释20～100倍后作为第三轮P...
【专利技术属性】
技术研发人员：金仲恩，陈晋纳，欧阳智琨，喻国贞，张帆，全春兰，
申请(专利权)人：苏州蔻美新材料有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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