基于单分子测序的同卵双胞胎法医检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术涉及一种基于单分子测序的同卵双胞胎法医检测试剂盒及其检测方法，属于基因测序领域。所述检测试剂盒具体包括：PCR扩增引物、AMpure XP beads纯化磁珠以及单分子测序相关试剂。本发明专利技术还提供了所述检测试剂盒的检测方法。

【技术实现步骤摘要】
基于单分子测序的同卵双胞胎法医检测试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及一种基于单分子测序的同卵双胞胎法医检测试剂盒及其检测方法，属于基因测序领域。
技术介绍
法医DNA分析技术随着基因研究领域的高速发展，越来越多的为涉及个体识别的案件提供客观依据。其主要原理为通过检测个体之间基因层面存在的差别，对不同个体进行识别。现在已经成为法庭科学中的一项重要组成部分。但是在涉及同卵双胞胎的案件中，由于其二者由同一受精卵发育而成，基因极为相似，虽然在同卵双胞胎的基因并非100％一致，但由于二者间差异非常细小，传统DNA分析手段无法确认嫌疑人究竟是同卵双胞胎的哪一位，故亟待找到一种可以检测到同卵双胞胎个体间在基因层面上区别的方法，以对这种“基因相同”的不同个体进行区别。寻找解决方案的其中一个方向就是找到一个标记基因，根据其在双胞胎之间的差异为个体识别提供依据。近年来大量文献表明DYZ1这一人类Y染色体中的基因，可以在同卵双胞胎间作为标记基因对其进行区分【1】，基因名为DYZ1的卫星序列约占人类Y染色体总量的20％【2】，男性Y染色体中中DYZ1被鉴定为一个3.4kb大小的条带【3】，其主要包含一5核苷酸重复模组，如“ttcaa”“atcca”“ttaca”等，一个正常男性Y染色体包含3000-3400个DYZ1序列的拷贝，虽然DYZ1基因不参与重组【4】，但其也被推测其在基因组中中具有重要性，大量重复的序列片段会承载不适当的突变负荷。DYZ1现在报告在染色质折叠和维护中起着至关重要的作用。由于DYZ1处于人类Y染色体异染色体区域，理论上同卵双胞胎的受精卵在分裂早期阶段，各自的Y染色体会发生缠绕而发生变异，在发育为个体后便能偶以这些突变作为标记予以区分。Sahu等人利用限制性内切酶酶谱分析和sanger测序的方法证明DYZ1基因在同卵双胞胎中具有多态性【1】。此研究结果为DYZ1作为一种用于同卵双胞胎个体识别基因标记提供理论基础。但在这Sahu的研究中，他们采用sanger法对DYZ1基因进行测序，这种方法不但工作量大，用时长，更重要的是在对DYZ1拷贝进行测序时，由于其主要由多种重复单元组成，一代和读长(800bp)无法跨越重复区，加之DYZ1序列本身拷贝量庞大，测序得出的相似的碎片化的序列信息就无法拼接。【1】Sahu,Monalisha,andJosyulaG.Prasuna."Twinstudies:Auniqueepidemiologicaltool."IndianJournalofCommunityMedicine:OfficialPublicationofIndianAssociationofPreventive&SocialMedicine41.3(2016):177.【2】YadavSK,KumariA,AliS:FateofthehumanYchromosomelinkedgenesandlociinprostatecancercelllinesDU145andLNCaP.BMCGenomics2013,14:323.}【3】NakahoriY,MitaniK,YamadaM,NakgomeY:AhumanYchromosomespecificrepeatedDNAfamily(DYZ1)consistsofatandemarrayofpentanucleotides.NucleicAcidRes1986,14:7569–7580.【4】LahnBT,PearsonNM,JegalianK:ThehumanYchromosomeinthelightofevolution.NatRevGenet2001,2:207–216
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种同卵双胞胎法医检测试剂盒，其基于单分子实时DNA测序技术对人体Y染色体DYZ1片段进行测序，具体包括：PCR扩增引物、AMpureXPbeads纯化磁珠以及单分子测序相关试剂。在一个实施方案中，所述PCR扩增引物序列如下：正向：3’-CCTTTCCTTTCGCTTGCATTCCAT-5’反向：3’-CATTGACTGGAAAGGCTGGGTG-5’。在又一个实施方案中，所述PCR扩增引物序列如下：正向：3’-NNNNNNNNNNNNNNNNCCTTTCCTTTCGCTTGCATTCCAT-5’反向：3’-NNNNNNNNNNNNNNNNCATTGACTGGAAAGGCTGGGTG-5’；其中，所述引物序列中的NNNNNNNNNNNNNNNN为barcode序列，共16个碱基。其是根据pacbio公司公布的“barcode指南”而获得的。在另一个实施方案中，所述AMpureXPbeads纯化磁珠用于对PCR扩增产物进行纯化。所述单分子测序相关试剂包括测序引物结合试剂、连接测序酶试剂以及Magbeads纯化试剂。本专利技术的目的之二是提供一种采用所述同卵双胞胎法医检测试剂盒的检测方法，所述检测方法仅用于个体识别，具体步骤如下：1)采用所述PCR扩增引物扩增目的片段DYZ1；2)采用AMpureXPbeads纯化磁珠用于对PCR扩增产物进行纯化；3)单分子测序建库；4)上样测序比对获得结果。在一个实施方案中，所述单分子测序建库步骤分为：a、结合测序引物；b、结合测序酶；c、Magbeads纯化。因此本专利技术通过使用单分子实时DNA测序技术平台解决了DYZ1在作为标记基因时测序困难的问题。第三代基因测序技术又被为"SingleMoleculeRealTime(SMRTTM)DNASequencing"(单分子实时DNA测序技术)，该方法基于纳米孔的单分子读取技术，可快速读取序列。其优势非常明显，其测序读长很长：平均测序读长能达到3000至5000碱基，最长的序列能达到20000碱基。而且其准确率高：对基因组变异检测，可以最高达到99.999％的准确率；选用特殊测序模式，测序准确率可以在达到单个分子99％准确率的条件下，读长超过经典的Sanger测序法。与sanger测序相比，PacBio的超长读长，可以跨越DYZ1的重复区，测量出真实的DYZ1序列，实现对DYZ1准确度高，操作简便快捷的测序需要。附图说明图1：实施例2中不同引物序列的扩增结果，泳道1-10分别对应组1-10引物序列所扩增的引物片段具体实施方式还可进一步通过实施例来理解本专利技术，其中所述实施例说明了一些制备或使用方法。然而，要理解的是，这些实施例不限制本专利技术。现在已知的或进一步开发的本专利技术的变化被认为落入本文中描述的和以下要求保护的本专利技术范围之内。实施例1(一)扩增目的片段DYZ1首先将3对同卵双胞胎的基因组样本进行编号：六个样品分别来自三对同卵双胞胎，样品1、2为一对，样品3、4为一对，样品5、6为一对。以其为模板对其进行PCR扩增。引物序列：正向：NNNNNNNNNNNNNNNN(Pacbioindex16nt)CCTTTCCTTTCGCTTGCATTCCAT反向：NNNNNNNNNNNNNNNN(Pacbioindex16nt)CATTGACTGGAAAGGCTGGGTGPCR体系(50uL)TemplateDNA10ngLATaq(Takara)0.5uL(2U)For本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同卵双胞胎法医检测试剂盒，其基于单分子实时DNA测序技术对人体Y染色体DYZ1片段进行测序，具体包括：PCR扩增引物、AMpure XP beads纯化磁珠以及单分子测序相关试剂。

【技术特征摘要】
1.一种同卵双胞胎法医检测试剂盒，其基于单分子实时DNA测序技术对人体Y染色体DYZ1片段进行测序，具体包括：PCR扩增引物、AMpureXPbeads纯化磁珠以及单分子测序相关试剂。2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增引物序列如下：正向：3’-CCTTTCCTTTCGCTTGCATTCCAT-5’反向：3’-CATTGACTGGAAAGGCTGGGTG-5’。3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增引物序列如下：正向：3’-NNNNNNNNNNNNNNNNCCTTTCCTTTCGCTTGCATTCCAT-5’反向：3’-NNNNNNNNNNNNNNNNCATTGACTGGAAAGGCTGGGTG-5’；其中，所述引物序列中的NNNNNNNNNNNNN...

【专利技术属性】
技术研发人员：王岩，王辉，张希，
申请(专利权)人：北京智鉴源技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11