大菱鲆雌雄辨别用引物组及使用其的大菱鲆雌雄辨别方法技术

本发明专利技术提供用于大菱鲆雌雄辨别的引物组，其特征在于，包含在大菱鲆的雌性生殖质中特异性地表达的芳香化酶基因的引物组SEQ ID No:1(5’‑TGAGAAAGAGCTGCTGGTGA‑3’)、SEQ ID No:2(5’‑CGTCTTGTGCTTCTGGTGAA‑3’)。另外，为了准确地比较芳香化酶的表达，提供大菱鲆生殖质的特异性vasa基因的引物组SEQ ID No:3(5’‑ACCGTCAGACCCTGATGTTC‑3’)、SEQ ID No:4(5’‑GCGTTCTGTTCCTGTGGTTT‑3’)以及作为看家基因的ef1a基因的引物组SEQ ID No:5(5’‑CGTTGGTGTCAACAAGATGG‑3’)、SEQ ID No:6(5’‑ATCCAGAGATGGGGACAAAG‑3’)，从而能够在种苗阶段准确而容易地辨别雌雄，进而提高最近作为优良养殖鱼种而受到瞩目的大菱鲆的养殖中的养殖效率。

Primer set for male female discrimination of turbot and male and female discrimination method for turbot using the same

The invention provides a primer set for turbot male and female discrimination, which is characterized in that contains specific aromatase expression in the female reproductive quality of turbot in the group of SEQ ID No:1 primer (5 'TGAGAAAGAGCTGCTGGTGA 3'), SEQ ID (No:2 CGTCTTGTGCTTCTGGTGAA 5 '3'). In addition, in order to accurately compare the expression of aromatase, provide specific vasa gene of turbot germ plasm primer group SEQ ID No:3 (5 \ACCGTCAGACCCTGATGTTC 3\), SEQ ID No:4 (5 \GCGTTCTGTTCCTGTGGTTT 3\) as well as ef1a based housekeeping genes primers for SEQ group ID No:5 (5 \CGTTGGTGTCAACAAGATGG 3\), SEQ ID (No:6 ATCCAGAGATGGGGACAAAG 5 '3'), which can accurately and easily distinguish between male and female in seedling stage, and improve the recent attention as good aquaculture species and turbot turbot breeding in the breeding efficiency.

【技术实现步骤摘要】
大菱鲆雌雄辨别用引物组及使用其的大菱鲆雌雄辨别方法
本专利技术涉及用于大菱鲆的雌雄辨别的引物组及使用其来辨别大菱鲆的雌雄的方法，更具体而言，本专利技术涉及能够通过测定对生成大菱鲆的性激素而言重要的芳香化酶基因表达量而在种苗阶段快速而准确地辨别大菱鲆的雌雄的方法。
技术介绍
在水产养殖中，养殖鱼种的性别辨别对养殖的效率性起到重要的作用。即，这是因为生长速度或者产业价值会根据性别而有所不同，因此在养殖生产性上产生大的差异。鳗鲡鱼或比目鱼等物种是雌性的生长速度更快，而罗非鱼则是雄性的生长速度更快。另外，对于鲑鱼或真鲷而言，雌性的体色的消费者好感程度高，对于被食用生殖质的鲻鱼、香鱼而言，具有卵的雌性的养殖价值高。因此，挑选水产养殖的产业价值高的性别来进行饲养能够增大生产力，从而提高养殖的效率。作为鱼类性别的辨别方法，首先有通过外形特征来进行辨别的方法。根据在成熟期显现出的婚姻色或成熟的雌雄个体的外形特征来进行辨别，或者对生殖质进行组织学观察来进行辨别的方法均属于其中。对辐纹海猪鱼、犁齿鲷、鰟鮍等可通过体色来区别性别，对鲑鱼或海马等可用形态来区别性别。然而，由于这大部分属于在生长为成体之后在产卵期和发情期发生改变的情况，因此事实上不可能在鱼类的鱼苗阶段用肉眼来区别性别。除了外观上的辨别以外，还有在卵形成过程中测定作为卵黄形成前体的卵黄蛋白原的方法。然而，该方法也属于在性成熟之后才能够进行的方法，因此同样不能够在属于未成熟期的种苗阶段进行辨别。除此以外，还有通过分子生物学方法来辨别性别的方法，但鱼类与哺乳类不同，不仅具有性染色体的鱼种不多，而且仅由性染色体不能够决定性腺性别，受到如性分化期的水温等环境影响而发生性别改变的鱼种较多。已知，除了这种根据生态情况来改变性别的鱼类以外，对于根据生长初期的环境而具有与遗传性别(geneticgender)不同的性别的情况，主要根据生殖腺的发育而显现出性腺性别(gonadalgender)，对于水产养殖中作为产业上重要的养殖鱼类的比目鱼等的情况，除了遗传性状以外，根据水温等环境条件，生殖腺发育形成得不同，并且性别被决定。另外已知，即使遗传上为雌性(XX)，在高水温和低水温下饲养时也会性分化为性腺雄性。基于这样的理由，基因辨别的方法也难以在种苗阶段辨别鱼类的性别。另外，大菱鲆(turbot；Scophthalmusmaximus)为生活在大西洋沿岸、欧洲海岸、北大西洋、波罗的海、地中海以及黑海周边的比目鱼科鱼类。大菱鲆作为不在东北亚栖息的外来鱼种，在比较冰冷的海洋中栖息，具有从非对称菱形趋近于圆形程度的宽大的体型，因而具有与比目鱼相类似的外形。对于体色，生活在沙中的个体与生活在暗礁中的个体相互不同，与其它鲽鱼科鱼类同样地随着栖息环境而改变体色。眼镜的位置如韩国的普通的比目鱼(偏口鱼)那样，从正面观察时偏向于左侧。大菱鲆养殖始于法国，目前在西班牙、葡萄牙、丹麦及荷兰等欧洲以及以中国为首的亚洲进行着养殖。韩国从2012年开始进行利用济州岛的熔岩地下海水的养殖，目前少量地流通。这种大菱鲆具有如比目鱼那样的雌性生长得快于雄性的特性，因此需要开发在养殖的种苗阶段能够在鱼苗阶段中快速而准确地区别表现得不同于遗传性别的性腺性别的技术。现有技术文献专利文献韩国注册专利第10-1418139号韩国注册专利第10-1281529号韩国注册专利第10-1499689号韩国公开专利第10-2014-0071579号
技术实现思路
技术课题本专利技术的目的在于提供雌雄辨别方法，其中该雌雄辨别方法能够在种苗阶段准确而容易地辨别雌雄，从而解决水产养殖中不易在种苗阶段辨别养殖鱼的雌雄的问题，并且利用最近作为高附加值养殖鱼种而受到瞩目的大菱鲆的养殖中的雌性比雄性快速生长的特性来提高养殖效率。技术方案为了解决上述问题，本专利技术提供用于大菱鲆雌雄辨别的引物组，其特征在于，包含在大菱鲆的雌性生殖质中特异性地表达的芳香化酶(aromatase)基因的引物组SEQIDNo:1(5’-TGAGAAAGAGCTGCTGGTGA-3’)、SEQIDNo:2(5’-CGTCTTGTGCTTCTGGTGAA-3’)。另外，为了准确地比较芳香化酶的表达，提供大菱鲆生殖质的特异性vasa基因的引物组SEQIDNo:3(5’-ACCGTCAGACCCTGATGTTC-3’)、SEQIDNo:4(5’-GCGTTCTGTTCCTGTGGTTT-3’)以及作为看家基因的ef1a基因的引物组SEQIDNo:5(5’-CGTTGGTGTCAACAAGATGG-3’)、SEQIDNo:6(5’-ATCCAGAGATGGGGACAAAG-3’)。有益效果通过根据本专利技术的用于大菱鲆雌雄辨别的引物组及使用其来辨别大菱鲆雌雄的方法，能够在种苗阶段准确地辨别大菱鲆的雌雄，从而能够挑选出因生长快速而对养殖有利的雌性来进行饲养。附图说明图1示出从大菱鲆卵巢的cDNA分离的Ef1α、VASA、芳香化酶的部分核苷酸序列及在分析中使用的引物的位置(下划线部分)。图2是在实验中使用的大菱鲆雌雄个体的生殖质的组织学观察照片。图3是示出利用根据本专利技术的芳香化酶、vasa和ef1α的引物组在大菱鲆的雌性和雄性生殖质中扩增后的扩增产物的电泳结果的照片。图4是根据组织分别示出大菱鲆芳香化酶基因的相对表达量的图表。图5是示出大菱鲆的雄性和雌性个体的生殖质中的芳香化酶的相对表达量的图表，其中(A)是示出雄性和雌性的芳香化酶的相对表达量的图表，(B)是芳香化酶和vasa的熔解曲线。具体实施方式本专利技术涉及通过测定作为对于大菱鲆的雌性激素生成而言重要的芳香酶的芳香化酶基因表达量，从而能够在种苗阶段的早期快速而准确地辨别大菱鲆的雌雄的方法。下面，举出具体实施例来详细地说明本专利技术。I.大菱鲆生殖质特异性芳香化酶和vasa以及ef1-α引物的制备为了辨别大菱鲆的性别，制备用于扩增大菱鲆生殖质特异性基因的引物。芳香化酶作为对合成属于雌性激素的雌二醇-17b起决定性作用的酶，其被用作大菱鲆的雌雄辨别的标志物。另外，Vasa作为仅在生殖腺中被表达的基因，由于不容易从种苗阶段的小个体提取生殖质，因此将仅在生殖腺中被特异性地表达的vasa基因用作看家基因，从而提高芳香化酶的表达的准确性。图1示出从大菱鲆卵巢cDNA分离的Ef1α、VASA、芳香化酶的部分核苷酸序列以及分析中使用的引物的位置(下划线部分)。大菱鲆生殖质特异性vasa引物是基于NCBIGenBank的已报告序列(大菱鲆(Scophthalmusmaximus)vasamRNA，完整的cds，GenBank登录号：JX266620.1)制备的，并且芳香化酶和ef1-α引物是基于比目鱼的芳香化酶的已报告序列(牙鲆(Paralichthysolivaceus)的P450芳香化酶的P450arommRNA，完整的cds，GenBank登录号：AB017182.1/牙鲆(Paralichthysolivaceus)的延伸因子1α的Ef1amRNA，完整的cds，GenBank登录号：AB915949.1)制备的，是将源自大菱鲆卵巢的PCR产物克隆之后，基于测序结果利用Primer3(Version0.4.0)制备的。已向GenBank申请本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于大菱鲆雌雄辨别的引物组，其特征在于，包含在大菱鲆的雌性生殖质中特异性地表达的芳香化酶基因的引物组SEQ ID No:1和SEQ ID No:2。

【技术特征摘要】
2016.02.24 KR 10-2016-00215751.用于大菱鲆雌雄辨别的引物组，其特征在于，包含在大菱鲆的雌性生殖质中特异性地表达的芳香化酶基因的引物组SEQIDNo:1和SEQIDNo:2。2.如权利要求1所述的用于大菱鲆雌雄辨别的引物组，其特征在于，还包含在大菱鲆生殖质中特异性地表达的vasa基因的引物组SEQIDNo:3和SEQIDNo:4，以使所述大菱鲆的雌性生殖质中的特异性芳香化酶基因的表达标准化。3.如权利要求2所述的用于大菱鲆雌雄辨别的引物组，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐钟表，李禹宰，郑泰成，林奉洙，吴泰宪，尹英硕，
申请(专利权)人：营渔组合法人海渊，
类型：发明
国别省市：韩国,KR