生物技术制备甲基化的肉桂酸和肉桂酸酯、甲基化的苯乙胺和其偶联产物的方法技术

本发明专利技术涉及提供用于利用4′‑O‑甲基转移酶以及必要时与其他酶结合来来制备3,4‑甲基化的肉桂酸、3,4‑甲基化的肉桂酸酯、3,4‑二甲氧基苯乙胺和4‑甲基肉桂酸酰胺的发酵和生物技术方法，其中酶借助于代谢工程选择并且必要时所述酶通过有针对性的优化来调整，以及涉及组合物，所述组合物通过所述方法获得。此外，本发明专利技术涉及载体体系、重组的微生物或真菌，以及特定的核酸片段和多肽。

【技术实现步骤摘要】
生物技术制备甲基化的肉桂酸和肉桂酸酯、甲基化的苯乙胺和其偶联产物的方法
本专利技术涉及用于利用4′-O-甲基转移酶、必要时与S-腺苷甲硫氨酸合成酶或3′-O-甲基转移酶和其他酶组合来制备3,4-甲基化的肉桂酸、3,4-甲基化的肉桂酸酯、3,4-二甲氧基苯乙胺和4-甲基肉桂酸酰胺的发酵方法和生物技术方法。此外，本专利技术涉及载体体系和重组的微生物或真菌，所述重组的微生物或真菌能够编码/表达用来执行本专利技术的酶以及涉及为此适合的核酸片段和多肽。此外，本专利技术涉及组合物，所述组合物通过根据本专利技术的方法获得。
技术介绍
在调味剂的工业生产领域中，对于合成所述调味剂的高效的和成本低的途径存在持续的需求。甲基化的肉桂酸和肉桂酸酯、甲基化的苯乙胺和其偶联产物、尤其是肉桂酸酰胺的偶联产物是这类调味剂的实例。示例性的肉桂酸酰胺是罗宾红素(Rubemamin)。罗宾红素作为天然材料在植物花椒草中被鉴定出。然而，现在仍没有描述过用于制备所述专门的物质以及其直接的前体的生物技术方法。从现有技术已知：咖啡酸通过不同的咖啡酰-辅酶A-O-甲基转移酶(CcAOMT)或邻苯二酚-O-甲基转移酶(COMT)和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用重组的微生物或真菌来制备3,4‑甲基化的肉桂酸或3,4‑甲基化的肉桂酸酯的方法，所述方法包括下列步骤：(i)提供重组的微生物或真菌，所述重组的微生物或真菌包含‑(a1)核酸片段，所述核酸片段包括至少一种编码4′‑O‑甲基转移酶的基因或由其构成，和‑(a2)可选的核酸片段，所述核酸片段包括至少一种编码3′‑O‑甲基转移酶的基因或由其构成，和‑(b)可选的用于发酵制备的核酸片段，所述核酸片段包括用于编码S‑腺苷甲硫氨酸合成酶的基因或由其构成；(ii)在允许核酸片段表达的条件下培养重组的微生物或真菌来获得相应的表达产物；(iii)可选地分离以及必要时纯化获得的表达产物；(iv)将一种或多种羟...

【技术特征摘要】
1.一种利用重组的微生物或真菌来制备3,4-甲基化的肉桂酸或3,4-甲基化的肉桂酸酯的方法，所述方法包括下列步骤：(i)提供重组的微生物或真菌，所述重组的微生物或真菌包含-(a1)核酸片段，所述核酸片段包括至少一种编码4′-O-甲基转移酶的基因或由其构成，和-(a2)可选的核酸片段，所述核酸片段包括至少一种编码3′-O-甲基转移酶的基因或由其构成，和-(b)可选的用于发酵制备的核酸片段，所述核酸片段包括用于编码S-腺苷甲硫氨酸合成酶的基因或由其构成；(ii)在允许核酸片段表达的条件下培养重组的微生物或真菌来获得相应的表达产物；(iii)可选地分离以及必要时纯化获得的表达产物；(iv)将一种或多种羟基肉桂酸、优选咖啡酸或阿魏酸，可选地以在半纤维素上酯化的方式，添加至根据步骤(ii)的培养的重组的微生物或真菌以用于发酵反应或添加至根据步骤(iii)的表达产物以用于酶促反应，和/或将一种或多种羟基肉桂酸的前体或一种或多种羟基肉桂酸的衍生物、尤其咖啡酸或阿魏酸的前体或衍生物，可选地以在半纤维素上酯化的方式，添加至根据步骤(ii)的培养的重组的微生物或真菌以用于发酵反应或添加至将根据步骤(iii)的表达产物以用于酶促反应；(v)并且在实现将羟基肉桂酸或其一种或多种前体或其衍生物反应成3,4-甲基化的肉桂酸或3,4-甲基化的肉桂酸酯的条件下培养或孵育重组的微生物或真菌或表达产物以获得相应的3,4-甲基化的肉桂酸或3,4-甲基化的肉桂酸酯；(vi)可选地分离以及必要时纯化获得的3,4-甲基化的肉桂酸或3,4-甲基化的肉桂酸酯以及可选地分离以及必要时纯化可能存在的其他副产物。2.利用重组的微生物或真菌来制备3,4-二甲氧基苯乙胺的方法，所述方法包括下列步骤：(i)提供重组的微生物或真菌，所述重组的微生物或真菌包含-(a1)核酸片段，所述核酸片段包括至少一种编码4′-O-甲基转移酶的基因或由其构成，和-(a2)核酸片段，所述核酸片段包括至少一种编码3′-O-甲基转移酶的基因或由其构成，和-(b)可选的核酸片段，所述核酸片段包括编码S-腺苷甲硫氨酸合成酶的基因或由其构成，和-(c)可选的核酸片段，所述核酸片段包括编码多巴脱羧酶的基因或由其构成，(ii)在允许核酸片段表达的条件下培养重组的微生物或真菌以获得相应的表达产物；(iii)可选地分离以及必要时纯化获得的表达产物；(iv)将多巴胺和/或L-二羟基苯丙氨酸和/或一种或多种其前体或一种或多种其衍生物、尤其一种其前体或一种其衍生物、尤其酪氨酸或苯丙氨酸添加至根据步骤(ii)的培养的重组的微生物或真菌以用于发酵反应或添加至根据步骤(iii)的表达产物以用于酶促反应，其中在酶促反应的情况下还优选添加S-腺苷甲硫氨酸；和(v)在实现将多巴胺或L-二羟基苯丙氨酸和/或其一种或多种前体或其衍生物反应成3,4-二甲氧基苯乙胺的条件下培养或孵育重组的微生物或真菌或表达产物以获得3,4-二甲氧基苯乙胺；(vi)可选地分离以及必要时纯化获得的3,4-二甲氧基苯乙胺以及可选地分离以及必要时纯化可能存在的其他副产物。3.利用重组的微生物或真菌来制备4-甲基肉桂酸酰胺的方法，所述方法包括下列步骤：(i)提供如在权利要求1中限定的重组的微生物或真菌，所述重组的微生物或真菌附加地包含-(d)核酸片段，所述核酸片段包括至少一种编码4-香豆酸:辅酶A连接酶的基因或由其构成，和-(e)核酸片段，所述核酸片段包括用于编码酪胺-N-羟基肉桂酰转移酶的基因或由其构成，和-(f)可选的核酸片段，所述核酸片段包括用于编码多巴脱羧酶的基因或由其构成，(ii)在允许核酸片段表达的条件下培养重组的微生物或真菌以获得相应的表达产物；(iii)可选地分离以及必要时纯化获得的表达产物；(iv)将多巴胺和/或L-二羟基苯丙氨酸和羟基肉桂酸、优选咖啡酸或阿魏酸添加至根据步骤(ii)的培养的重组的微生物或真菌以用于发酵反应，或将苯乙胺、尤其多巴胺、3-甲氧酪胺、3-羟基-4-甲基苯乙胺、3,4-二甲氧基苯乙胺和肉桂酸酯、尤其咖啡酸的、阿魏酸的、异阿魏酸的或3,4-二甲氧基肉桂酸的酯添加至根据步骤(iii)的表达产物以用于酶促反应，其中在酶促反应的情况下此外优选添加S-腺苷甲硫氨酸；和(v)在实现多巴胺和/或L-二羟基苯丙氨酸和羟基肉桂酸反正成4-甲基肉桂酸酰胺的条件下培养或孵育重组的微生物或真菌或表达产物，可选地添加连接酶；(vi)可选地分离以及必要时纯化获得的4-甲基肉桂酸酰胺以及必要时纯化可能存在的其他副产物。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述4-甲基肉桂酸酰胺选自：罗宾红素、[(2E)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-N-[2-(3,4-二甲氧基)乙基]2-丙烯酰胺]、阿魏酰-3-甲氧基酪胺[(2E)-3-(4-羟基-3-甲氧基苯基丙酮)-N-[2-(4-羟基-3-甲氧基苯基丙酮)乙基]2-丙烯酰胺]、(2E)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-N-[2-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)乙基]2-丙烯酰胺]和3,4-二甲氧基肉桂酰甲氧酪胺[(2E)-3-(3,4-二甲氧基苯...

【专利技术属性】
技术研发人员：格哈德·克拉默尔，雅各布·彼得·莱伊，卡特林·盖斯勒，托尔斯滕·盖斯勒，弗劳克·戈莫尔，彼得·韦尔特斯，吉多·雅赫，卢德格尔·A·韦斯约翰，
申请(专利权)人：西姆莱斯有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE