用于修复软骨损伤的方法技术

一种修复软骨损伤的方法，所述方法包括：(a)在具有软骨损伤的患者中形成微骨折或实施其他骨髓刺激技术；和(b)向所述微骨折施用组合物，其中所述组合物包含能够再生有序透明软骨的试剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于修复软骨损伤的方法相关申请的交叉引用本申请要求2014年6月6日提交的美国临时专利申请62/008,513的优先权，其全部内容在此参考并入。专利
本专利技术一般涉及用于修复软骨损伤的方法。
技术介绍
关节软骨是一种具有较低细胞密度和有限营养供应的高度有序的组织。一旦被创伤或退行性关节炎损伤，其具有有限的再生能力。最常见的关节疾病骨关节炎(OA)使数百万人出现包括关节严重疼痛、肿胀和弹响在内的症状。更糟糕的是，OA不能被治愈，仅能够控制其症状。OA是最常见的关节炎形式并且是全世界第四大致残原因。据估计超过70％的年龄在55岁至70岁之间的美国人受到OA影响。OA的治疗仍然是一个艰巨的挑战并且对医疗保健系统造成了巨大的负担。目前的治疗主要由保守性的缓解疼痛和物理疗法组成，其不改变疾病过程，并且大部分OA患者将发展到晚期且需要全关节置换。OA的特征为进行性关节软骨破坏，并且最终导致滑膜关节的功能衰竭。软骨再生已成为用于OA治疗的一种具有吸引力的方法。由于透明软骨不能在体内自发再生，用于修复关节软骨的策略是用软骨移植物或组织工程化的软骨样组织填充间隙，或刺激祖细胞在原位分化成软骨细胞。尽管已有使用自体软骨移植物成功修复的报道，但是这种方法存在显著缺点。自体软骨移植需要来自关节软骨不承重或承重较小区域的供体组织，其供应有限并且导致供体部位新的发病。软骨细胞的体外扩增可能导致软骨细胞去分化和细胞供应不足。体外基质辅助组织工程涉及长时间的细胞和多项手术操作。由于这些原因，软骨的原位再生是修复有缺陷的关节软骨非常理想的策略。进行软骨修复的通常方式是微骨折诱导的骨髓间充质干细胞(MSC)向软骨缺陷部位迁移和促进纤维软骨产生(图1A)。该方法涉及在位于受损软骨下方区域的软骨下骨髓空间钻出小洞，其诱发缺陷部位出血并导致血液凝块的形成。凝块含有来自骨髓的多能MSC，其具有分化成成软骨细胞和软骨细胞的潜能。微骨折是一种简单易行、微创和单阶段操作，其发病率和花费均较低。然而，与其他手术操作一样，所形成的软骨是纤维软骨。从长远来看纤维软骨是不耐用的并且在功能上是不足的。与透明软骨不同，纤维软骨对剪切力的抗性较差。在正常生理条件下，透明软骨作为关节软骨在桡关节中提供减震和润滑作用。作为高度有序的组织，透明软骨是非常耐用的，这归因于其由软骨细胞产生并且由胶原蛋白纤维、蛋白聚糖和其他基质蛋白组成的细胞外基质，所述胶原蛋白纤维由II型、IX型和XI型胶原蛋白分子组成。透明软骨具有较差的内在愈合能力。作为瘢痕组织的一种，纤维软骨表达I型和II型胶原蛋白；而相反的是，透明软骨不表达I型胶原蛋白。由于I型胶原蛋白的存在削弱了胶原蛋白特异性基质的结构和机械功能，因而由纤维软骨对软骨损伤的修复导致发病和功能受损。因此，软骨损伤修复的目标是再生有序透明软骨。使用透明软骨而非纤维软骨的软骨损伤愈合仍是一项具有挑战性的临床问题。因此，对利用再生有序透明软骨修复软骨损伤的方法仍存在持续的需求。专利技术概述本申请提供了一种修复软骨损伤的方法及其使用的组合物。在某些实施方式中，该方法包括：(a)在具有软骨损伤的患者中形成微骨折或实施其他的骨髓刺激技术；和(b)向该微骨折部位施用组合物，其中该组合物包含能够再生有序透明软骨的试剂。在一些实施方式中，该试剂能够诱导间充质干细胞(MSC)分化为软骨细胞。在一些实施方式中，该试剂是多肽。在一些实施方式中，该试剂是包含效应结构域的多肽。在一些实施方式中，所述效应结构域是软骨形成转录因子。优选地，所述软骨形成转录因子是SOX9。在某些实施方式中，所述转录因子是具有增强的细胞穿透肽的SOX9的变体。在某些实施方式中，所述转录因子是具有被破坏的核输出肽的SOX9的变体。在一些实施方式中，该试剂是核酸。在一些实施方式中，该试剂是编码包含软骨形成转录因子的多肽的核酸。优选地，所述软骨形成转录因子是SOX9。在一些实施方式中，该试剂是化合物或小分子。在一些实施方式中，该试剂能够刺激SOX9的表达。此类试剂包括胰岛素样生长因子1(IGF-1)、成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子-β(TGF-β)。在一些实施方式中，该试剂需要在核中才能发挥作用。因此，在一些实施方式中，该试剂还包含转导结构域以促进其穿透细胞膜并进入细胞核。所述转导结构域能够使转录因子转位进入细胞或者甚至是细胞核。在一些实施方式中，所述转导结构域由以下组成：TAT、聚精氨酸、穿膜肽(Penetratin，Antennapedia)、VP22、转运素(Pransportan)、MAP、MTS和PEP-1。在试剂是多肽的情况下，所述转导结构域可以与多肽的N-末端或C-末端融合。在一些实施方式中，该试剂包含能够辅助其进入细胞核的核定位信号。在一些实施方式中，该试剂包含可转导的超电荷肽。在一些实施方式中，所述超电荷肽是超电荷GFP。在一些实施方式中，该试剂在从其天然序列被修饰或突变成超电形式或其他可转导形式后被转导。在一些实施方式中，所述试剂被修饰以包含作为一些细胞表面受体的配体并且将通过受体介导的内吞作用促进所述试剂进入细胞。在一些实施方式中，向微骨折部位施用的组合物还包含载体。在一些实施方式中，载体是聚合物或蛋白转导结构域PTD肽。在一些实施方式中，载体是胶原蛋白膜或其他生物相容性、可吸收膜或者生物相容性基质。在一些实施方式中，该试剂来自天然来源。在一些实施方式中，该试剂由大肠杆菌或其他表达系统使用重组DNA技术生产或者是合成的。在一些实施方式中，该方法还包括(c)向患者施用免疫抑制剂。在一些实施方式中，通过将试剂装载至载体如胶原蛋白膜而向微骨折部位施用组合物。然后，在操作过程中载体被置于和/或固定在微骨折部位表面上。在一些实施方式中，通过将组合物直接注射进入患者形成微骨折的滑膜腔中而施用该组合物。在另一个方面，本申请提供了一种修复软骨损伤的组合物。在某些实施方式中，该组合物包含如上文所述的能够再生有序透明软骨的试剂。在某些实施方式中，该组合物还包含载体。在一些实施方式中，所述载体是胶原蛋白膜。附图简述图1A：仅使用微骨折进行软骨修复的示意图。图1B：使用微骨折联合包含能够诱导透明软骨的试剂(例如可转导或能够穿透细胞的SOX9)的组合物进行软骨修复的示意图。图2：间充质干细胞(MSC)是多能的并且可以分化成几种细胞类型之一。Sox9蛋白的表达或转导将刺激MSC增殖并将MSC导向至软骨细胞结局。图3：SOX9HMG核定位信号的位置。SOX9高迁移率组(HMG)结构域含有两个核定位信号(NLS)。N-末端NLS(nNLS)结合钙调蛋白(CaM)和C-末端NLS(cNLS)结合输入蛋白-b(Impb)。Cam和Impb是参与通过核孔复合物转运大量蛋白的两个蛋白。因此，SOX9通过这两者活跃地转运至细胞核。图4：scSOX9(与SOX9融合的超电荷GFP或超电荷SOX9)诱导II型胶原蛋白表达增加，但诱导I型和X型胶原蛋白表达减少。使用含有1％FBS和高葡萄糖(4.5g/l)且仅加入缓冲液或10μg/mlscSOX9的DMEM培养人骨髓来源的MSC。在所示时间点，提取RNA并且基于使用TaqMan探针的RT-PCR对I型、II型和X本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种修复软骨损伤的方法，所述方法包括：(a)在具有软骨损伤的患者中形成微骨折或实施类似的骨髓刺激技术；和(b)向所述微骨折部位或可接近内源性MSC的位置施用组合物，其中所述组合物包含能够再生有序透明软骨的试剂。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.06 US 62/008,5131.一种修复软骨损伤的方法，所述方法包括：(a)在具有软骨损伤的患者中形成微骨折或实施类似的骨髓刺激技术；和(b)向所述微骨折部位或可接近内源性MSC的位置施用组合物，其中所述组合物包含能够再生有序透明软骨的试剂。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂能够诱导间充质干细胞分化为成软骨细胞和/或软骨细胞。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述试剂是多肽。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述多肽包含效应结构域。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述效应结构域是转录因子。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述转录因子是SOX9。7.根据权利要求5所述的方法，其中所述转录因子是具有增强的细胞穿透肽的SOX9的变体。8.根据权利要求5所述的方法，其中所述转录因子是具有被破坏的核输出序列的SOX9的变体。9.根据权利要求2所述的方法，其中所述试剂是核酸。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述核酸编码包含软骨形成转录因子的多肽。11.根据权利要求2所述的方法，其中所述试剂是化合物或小分子。12.根据权利要求2所述的方法，其中所述试剂刺激SOX9表达。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述试剂选自下组：IGF-1...

【专利技术属性】
技术研发人员：初从秋，朱勇，吴时丽，包骏，
申请(专利权)人：帷幄生物技术公司，
类型：发明
国别省市：美国,US