测定芦丁与蛋白结合水平的表面等离子体共振分析方法技术

本发明专利技术公开了一种测定芦丁与蛋白结合水平的表面等离子体共振(SPR)分析方法，分析对象为芦丁与蛋白的相互作用体系，分析目标为求得该相互作用反应的平衡常数。本方法中芦丁用吡啶溶解并以含有吡啶的缓冲溶液稀释，解决了芦丁在水溶液中溶解度不足的问题，使之产生足够强的SPR信号。此外，分析过程中在配制稀释的芦丁溶液时一一对应地配制了相同组分但不含芦丁的吡啶的稀释溶液，用于测定吡啶对SPR信号的影响，以准确获得芦丁产生的相互作用信号。

【技术实现步骤摘要】
测定芦丁与蛋白结合水平的表面等离子体共振分析方法
本专利技术涉及分析化学中表面等离子体共振技术的应用方法，具体涉及一种用于测定芦丁与蛋白质相互作用结合水平的表面等离子体共振分析方法。
技术介绍
表面等离子体共振(surfaceplasmonresonance,SPR)技术是一种在分子间相互作用的分析领域中广泛使用的方法。其基本原理为利用入射光照射SPR传感芯片，使得入射光产生的倏逝波与传感芯片表面金属的表面等离子波发生共振，影响出射光的性质；此后在传感芯片表面发生相互作用反应，引起共振条件的变化，导致出射光性质发生变化，对其进行监测即可实现对相互作用反应的检测。在一般的SPR分析过程中，相互作用反应的一个参与物往往通过共价键、静电作用、疏水作用等等方式被固定于SPR检测芯片表面，然后将另一个(或几个)反应的参与物溶解后流动通过该检测芯片表面。当发生相互作用反应时，反应物的结合或解离将导致检测芯片的表面性质发生改变，反映为仪器信号的改变。SPR技术可以进行快速、灵敏、无标记的分析，经常被用于测定相互作用反应的速率常数、平衡常数等物理化学数据。芦丁(rutin)是一种黄酮类化合物，在自然界，特别是植物中广泛分布，在一些植物的根、茎、叶、果实等器官和组织内都可以被发现。芦丁的结构式如下：芦丁具有明显的生理活性，是常见的食品和中药，例如荞麦、银杏、槐米、枸杞、芸香、益母草、芦荟、柴胡、桉叶，以及烟草中的重要活性成分。芦丁的结构式如图1所示。芦丁具有较强的抗氧化活性，在人体中可以维持血管壁的张力、提高其弹性，降低血管壁脆性和渗透性，因而可以改善微血管循环、降低血脂和胆固醇含量，可以在心脑血管疾病的治疗中发挥作用。此外，芦丁还具有一定的抑菌和抗衰老作用，并且可以影响胰岛素的分泌并提高胰岛素受体亲和力，在糖尿病治疗领域中也有一定的应用。芦丁进入人体后，需要通过与多种蛋白质发生相互作用以实现其生理、药理功能，例如其浓度较高时需要与血液中的人血清白蛋白(humanserumalbumin，HSA)发生结合从而随着血液循环而被输运到其他器官或组织，然后再解离以发挥生理功能，其功效发挥也和其与生物酶或者特异和非特异受体的结合有关。因此，研究芦丁与蛋白质相互作用的有关过程，特别是求得其与多种蛋白质发生结合反应的平衡常数，对其药理、药代动力学等研究具有重要意义。作为一种快速、无标记、实时的分析手段，SPR法本质上适合于芦丁-蛋白质相互作用的分析，但在实现过程中却存在着困难，即芦丁的溶解性问题。SPR是一种质量敏感型的分析方法，其信号强度取决于传感芯片表面附近(50纳米内)被测物质量的大小，因此当被分析物是芦丁等小分子物质时，它必须在水环境中有足够大的溶解度，以形成足够强的信号。特别地，为了模拟生理环境，SPR分析过程往往使用含有无机盐的缓冲溶液来制备样品溶液，这进一步导致了芦丁溶解度降低的问题。已有专利方法中并无使用SPR法研究芦丁与蛋白质相互作用的方法。因此，有必要通过分析步骤的改进，改善芦丁在水溶液中的溶解性，并以此为基础开发基于SPR的芦丁-蛋白质相互作用结合水平的快速分析测定方法。
技术实现思路
为了弥补现有方法的不足，特别是芦丁溶解度问题导致的分析困难，本专利技术的目的是提供一种基于表面等离子体共振原理的新型相互作用分析方法，实现对芦丁和蛋白质相互作用结合水平(即结合反应的平衡常数)的测定。本专利技术的分析方法包括传感芯片的清洁、芯片表面的羧基化修饰、蛋白质溶液pH的筛选、芯片表面羧基的活化、蛋白质的共价结合、芦丁的溶解与稀释、蛋白质与芦丁相互作用过程的测定、数据分析等步骤。具体过程如下，各步骤须依次进行。1、传感芯片的清洁。当SPR传感芯片(通常为镀金玻璃片)为可拆卸式结构时，将传感芯片整体浸没于由浓氨水、30％过氧化氢、水按体积比1:1:5混合而成的溶液中，并置于60-95℃环境中至少10分钟，然后以水清洗，干燥后使用。当传感芯片为不可拆卸式结构(即金属层直接镀于棱镜表面)时，在芯片表面检测窗口位置滴加上述溶液，并置于低于90℃但尽可能高(不损坏棱镜等结构)的温度下至少30分钟，然后以水洗净表面并干燥后使用。也可以使用全新传感芯片。优选的，每次分析流程均使用全新传感芯片，为镀有裸露金膜的玻璃片，一次性使用，分析完成后弃去。2、芯片表面的羧基化修饰。将清洁的传感芯片安装入SPR仪器后，使满足以下条件的溶液流通经过芯片表面：溶质为一种巯基取代的直链羧酸，其中巯基位于碳链远离羧基的另一个末端；碳链长度为含有三至二十碳原子，即巯基丙酸、巯基丁酸直至巯基二十烷酸之一；溶质浓度为2mmol/L至50mmol/L；溶剂为水和/或乙醇，视何者能将溶质溶解至所需浓度而定。流通过程中实时监测SPR信号，流通时间从进样后直到SPR信号不再变化为止，但至少为1分钟，溶液流速为0.1微升/分钟至1毫升/分钟，视流通池体积而定。以上步骤完成后以水冲洗整个管路和芯片表面。流通时芯片区域温度为0℃至60℃。优选的，使用5mmol/L的3-巯基丙酸水溶液以5微升/分钟的流速流通30分钟，芯片区域控温37℃，完成后以水冲洗管路和芯片表面。3、蛋白质溶液的pH筛选。本方法所针对的目标蛋白为水溶性蛋白质，其等电点大于4。实时监测SPR信号，使用满足以下条件的溶液流通经过芯片表面：蛋白质浓度为1纳克/毫升至50毫克/毫升中的某一个值；溶剂为乙酸-乙酸钠缓冲溶液，钠离子浓度为不超过50mmol/L的一个值；pH为2.5至6.0中的至少3个值，范围须覆盖至少2个pH单位，间隔至少为0.2，至多为1个pH单位。即，流通的溶液为几种固定蛋白种类和浓度、固定缓冲液浓度但pH不同的溶液。每个溶液流通相同的时间，介于5秒和60分钟之间，流速相同，介于0.1微升/分钟至1毫升/分钟之间。芯片区域温度为0℃至60℃间的一个值。比较各个不同pH的蛋白溶液流经羧基修饰的芯片时SPR信号的变化。若在所尝试的几个pH值中、所使用的流通时间下，各溶液均使SPR信号达到稳定，则选择稳定后信号与基线相差最大的溶液的pH用作后续分析；若在使用的流通时间下各溶液均未使信号达到稳定，则选择信号变化最快的溶液的pH用作后续分析；若部分达到稳定部分未达稳定，则选择流通完成时刻信号与基线相差最大的溶液的pH用作后续分析。此步骤完成后用水冲洗整个管路和芯片。优选的，将蛋白质分别溶解于钠离子浓度为10mmol/L，pH分别为4.0，4.5，5.0，5.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，以5微升/分钟的流速各流通5分钟，控温37℃，选择结束时信号变化最大的溶液的pH。4、芯片表面羧基的活化。选择下述两种方法之一将芯片表面修饰的巯基羧酸的羧基进行活化。其一，使满足以下条件的溶液流通经过芯片表面：溶质为EDC，即N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐和NHS，即N-羟基丁二酰亚胺，两者浓度均为0.0001至0.5克/毫升，且EDC浓度不低于NHS浓度，流速介于0.1微升/分钟至1毫升/分钟之间，流通时间以SPR信号不再变化为准，但至少为1分钟。芯片区域温度为0℃至60℃间的一个值。其二，先后使EDC溶液和NHS溶液分别流通经过芯片表面，各自浓度范围、流速均同上，流通时间均以各自的SPR信号不再变化为准，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定芦丁与蛋白结合水平的表面等离子体共振分析方法，包括以下步骤：1)对洁净的传感芯片进行表面羧基化修饰；2)筛选用于溶解目标蛋白的缓冲液的pH值；3)对传感芯片表面修饰的羧基进行活化；4)将目标蛋白溶解于步骤2)选定pH的缓冲液中，使之流经步骤3)活化的芯片表面，将目标蛋白共价结合到芯片上；5)配制芦丁浓度为c1、c2、…、ci的系列溶液，其中i为自然数；6)按浓度由稀至浓的顺序将步骤5)配制的芦丁溶液送入表面等离子体共振仪中，通过步骤4)处理后的传感芯片，记录每一个浓度为ci的芦丁溶液进样且信号稳定后的信号值Ri，同时，记录不含有芦丁但其他成分相同的对照溶液进样且信号稳定后的信号值ri；7)数据分析：计算各个1/ci和1/(Ri‑ri)，并以1/(Ri‑ri)对1/ci作图，1/ci为横坐标，1/(Ri‑ri)为纵坐标；对图中数据点进行线性拟合，所得方程的截距记为b，斜率记为a，则结合反应的平衡常数为b/a，单位为实验中所用浓度单位的倒数。

【技术特征摘要】
1.一种测定芦丁与蛋白结合水平的表面等离子体共振分析方法，包括以下步骤：1)对洁净的传感芯片进行表面羧基化修饰；2)筛选用于溶解目标蛋白的缓冲液的pH值；3)对传感芯片表面修饰的羧基进行活化；4)将目标蛋白溶解于步骤2)选定pH的缓冲液中，使之流经步骤3)活化的芯片表面，将目标蛋白共价结合到芯片上；5)配制芦丁浓度为c1、c2、…、ci的系列溶液，其中i为自然数；6)按浓度由稀至浓的顺序将步骤5)配制的芦丁溶液送入表面等离子体共振仪中，通过步骤4)处理后的传感芯片，记录每一个浓度为ci的芦丁溶液进样且信号稳定后的信号值Ri，同时，记录不含有芦丁但其他成分相同的对照溶液进样且信号稳定后的信号值ri；7)数据分析：计算各个1/ci和1/(Ri-ri)，并以1/(Ri-ri)对1/ci作图，1/ci为横坐标，1/(Ri-ri)为纵坐标；对图中数据点进行线性拟合，所得方程的截距记为b，斜率记为a，则结合反应的平衡常数为b/a，单位为实验中所用浓度单位的倒数。2.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，在步骤1)中，所述传感芯片为镀金玻璃片，使用由浓氨水、30％过氧化氢、水按体积比1:1:5混合而成的溶液进行清洁，然后以水洗净并干燥。3.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，在步骤1)对芯片进行表面羧基化修饰的方法是将芯片安装入表面等离子体共振仪，然后使用满足以下条件的溶液流通经过芯片表面：溶质为一种巯基取代的直链羧酸，其中巯基位于碳链远离羧基的另一个末端，碳链长度为含有三至二十碳原子，溶质浓度为2mmol/L至50mmol/L，溶剂为水和/或乙醇；流通过程中实时监测SPR信号，流通时间从进样后直到SPR信号不再变化为止，但至少为1分钟，溶液流速为0.1微升/分钟至1毫升/分钟。4.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，在步骤2)比较不同pH的蛋白溶液流经羧基修饰的芯片时SPR信号的变化：若在所尝试的几个pH值中，所使用的流通时间下，各溶液均使SPR信号达到稳定，则选择稳定后信号与基线相差最大的溶液的pH；若在使用的流通时间下各溶液均未使信号达到稳定，则选择信号变化最快的溶液的pH；若部分达到稳定部分未达稳定，则选择流通完成时刻信号与基线相差最大的溶液的pH。5.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤3)采用下述方法I或II对芯片表面修饰的羧...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘虎威，白玉，张一丁，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京,11