一种建立快速检测呼吸道样本中肺炎克雷伯菌三重qPCR方法技术

本发明专利技术提供了一种建立快速检测呼吸道样本中肺炎克雷伯菌三重qPCR方法，包括：临床呼吸道样本采集和选取；细菌培养与鉴定；核酸提取与纯化；质控/内标质粒构建；测序引物设计与合成；临床分离株高保真体系优化、扩增及结果判断；高保真PCR产物测序与质控；三重qPCR引物、探针设计与合成标记；三重qPCR体系优化、扩增及结果判断，本发明专利技术的有益效果在于：可同时检测肺炎克雷伯氏菌rcsA和23s RNA两个持家基因，所用引物和探针根据我国流行分布株基因测序结果有效避开变异区或突变点设计而成；痰液样本加入痰液快速液化杀菌剂，可快速完全液化、能杀死致病微生物，保护操作者不被感染；比既住方法缩短时间近一个小时，具有操作简便、快速、安全、灵敏的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种建立快速检测呼吸道样本中肺炎克雷伯菌三重qPCR方法
本专利技术涉及一种肺炎克雷伯菌三重qPCR方法，尤其涉及一种建立快速检测呼吸道样本中肺炎克雷伯菌三重qPCR方法。
技术介绍
肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)是呼吸道感染的病原菌之一，可引起较严重的下呼吸道感染甚至死亡，其临床症状与其他细菌感染并无两样，临床难以针对该菌精准治疗。近年来，由于无法早期精准治疗，其耐药问题日益突出，严重影响了治疗效果[1-2]。培养法是目前常用的检测方法，也是金标准，一般需要2-3天，甚至更久，其时效性、简便性、灵敏度等均无法满足临床快速精准诊断的需求[3]。实时荧光定量PCR(RealTimeQuantitativePCR，qPCR)通过检测遗传物质(DNA和/或RNA)，且快速、简便、灵敏度高，在病原微生物检测方面迅速发展，已成为金标准方法的重要补充[4-6]。比如，李明等于2011年公布了主要由：正向引物：5’-GCGCGCACCTATTGTGTTG-3’、反向引物：5’–TCGCTGTGCTTGTCATCCTT-3’和探针：5’-CCGTCTACACCCGG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种建立快速检测呼吸道样本中肺炎克雷伯菌三重qPCR方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)临床呼吸道样本采集和选取：痰液样本采用吸痰或深咳法，留取于无菌痰培养瓶内，经涂片革兰氏染色镜检，白细胞>25个/HP，鳞状上皮细胞<1O个/HP判为合格，否则弃用；肺泡灌洗液直接注入无菌痰培养瓶内，共收集合格样本若干份；(2)细菌培养与鉴定：将合格的痰液或肺泡灌洗液接种于血平板和麦康凯平板，置于35℃的CO2孵化箱内，培养24‑48小时；挑取灰白色、大而粘稠、有拉丝的可疑菌落，进行革兰氏染色、氧化酶和触酶试验，革兰氏阴性杆菌，氧化酶阴性和触酶阳性，再用细菌生化鉴定仪和基质辅助激光解析电离飞行时...

【技术特征摘要】
1.一种建立快速检测呼吸道样本中肺炎克雷伯菌三重qPCR方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)临床呼吸道样本采集和选取：痰液样本采用吸痰或深咳法，留取于无菌痰培养瓶内，经涂片革兰氏染色镜检，白细胞>25个/HP，鳞状上皮细胞<1O个/HP判为合格，否则弃用；肺泡灌洗液直接注入无菌痰培养瓶内，共收集合格样本若干份；(2)细菌培养与鉴定：将合格的痰液或肺泡灌洗液接种于血平板和麦康凯平板，置于35℃的CO2孵化箱内，培养24-48小时；挑取灰白色、大而粘稠、有拉丝的可疑菌落，进行革兰氏染色、氧化酶和触酶试验，革兰氏阴性杆菌，氧化酶阴性和触酶阳性，再用细菌生化鉴定仪和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪及配套试剂进行双鉴定，两种鉴定方法均报告为肺炎克雷伯菌的方法作为实验用菌株；(3)核酸提取与纯化：①痰液细菌基因组核酸提取与纯化：在痰液收集瓶中加入1-2倍体积痰液液化杀菌剂，漩涡振荡5分钟，吸取液化痰液100ul用核酸提取仪及配套试剂，上机提取纯化细菌基因组核酸；②肺泡灌洗液细菌基因组核酸提取：直接取肺泡灌洗液100ul同痰液一样上机提取纯化；③培养细菌基因组核酸提取：挑取纯培养菌落用生理盐水调成0.5MCF菌悬液，吸菌悬液100ul同痰液一样上机提取纯化；④将上述①、②、③提取纯化后的核酸吸入无酶EP管，冻存于-86℃冰箱备用；(4)质控/内标质粒构建：用DNAMN软件生成一段1000bp随机DNA序列，其中A、T、C、G四种碱基各占25％，插入PBSK载体构建质粒并提取质粒核酸；(5)测序引物设计与合成：从GenBank数据库下载肺炎克雷伯氏菌rcsA和23SrRNA基因序列各50条，用DNAMN比对软件分别进行比对，避开变异区或突变点后，用Primer5设计rcsA、23SrRNA基因和质控/内标质粒测序引物；(6)临床分离株高保真体系优化、扩增及结果判断：经优化，高保真PCR反应体系为25.0μL，包括2×Buffer12.5ul、dNTPMIX(10mMeach)0.5μL、10μM引物各0.5μL、53倍高保真热启动DNA聚合酶(1U/ul)0.5μL、50×EvaGreen0.5ul、模板5.0μL，加无菌双蒸水至终体系25.0μL；PCR扩增采用3步法，参数为：95℃2分钟；95℃10秒，59℃10秒，72℃30秒，30个循环，选择FAM通道于延伸阶段探测荧光，以含模板的扩增曲线呈“S”形，CT值≤21，扩增曲线与基线夹角≥30°，且不含模板的扩增曲线与基线平行，判为扩增良好，用该方法高保真扩增94株经步骤(2)所述方法确定为肺炎克雷伯菌的临床分离株rcsA和23SrRNA基因及质控/内标质粒；(7)高保真PCR产物测序与质控：将步骤(6)扩增良好的高保真PCR产物进行测序，以质控/内标质粒测序结果与步骤(4)所述序列100％符合方接受临床分离株测序结果；(8)三重qPCR引物、探针设计与合成标记：根据步骤(7)的测序分析比对结果，避开变异区或突变点后，用Primer5设计肺炎克雷伯菌rcsA和23SrRNA基因及质控/内标质粒引物和探针；(9)三重qPCR体系优化、扩增及结果判断：经优化后，三重qPCR反应体系为40.0μL，包括10×Buffer4.0ul、dNTPMIX(10mMeach)0.8μL、10μM引物各1.2μL、10μM探针各0.4μL、化学修饰热启动DNA聚合酶(1U/ul)0.5μL、抗体热启动DNA聚合酶(1U/ul)0.5μL、50Copies/ul质控/内标质粒0.1μL，模板20.0μL，加无菌双蒸水至终体系40.0μL；qPCR扩增采用两步法，参数为：95℃2分钟；95℃10秒，60℃30秒，40个循环，选择FAM、VIC和ROX三通道于退火延伸阶段探测荧光，以三个通道扩增曲线均呈“S”形，CT值均≤36，扩增曲线与基线夹角均≥30°判为阳性，否则判为阴性。2.根据权利要求1所述的建立快速检测呼吸道样本中肺炎克雷伯菌三重qPCR方法，其特征在于，步骤(9)之后还包括三重qPCR体系性能评价试验，所述三重qPCR体系性能评价试验为：(1)检测下限试验与判断：挑取对数生长期纯培养菌落用生理盐水调成约2.0×108cfu/ml，经平板菌落计数法确定浓度后稀释至1.0×108cfu/ml，10倍连续稀释成8个梯度浓度菌悬液，提取纯化核酸后，按步骤(9)所述方法和标准上机扩增及结果判断，以能判阳的最低加入模板数作为检测下限；(2)检测灵敏度试验与计算：提取纯化95株经步骤(2)所述方法确定为肺炎克雷伯菌的菌悬液核酸，按步骤(9)所述方法和标准上机扩增并判断结果；检测灵敏度＝阳性数÷95×100％；(3)检测特异性试验：提取纯化95株经步骤(2)所述方法确定为非肺炎克雷伯菌的其他呼吸道常见感染菌菌悬液核酸，按步骤(9)所述方法和标准上机扩增并判断结果；检测特异性＝阴性数÷95×100％；(4)真阳性、真阴性判断与验证；真阳性：①培养鉴定为肺炎克雷伯菌；②培养法阴性，按步骤(9)所述方法阳性，经步骤(6)和步骤(7)方法高保真扩增测序与肺炎克雷伯菌ATCC700603标株两基因的相同片段同源性≥90％；真阴性：①培养及qPCR两种检测方法均为阴性；②qPCR检测阳性，但经步骤(6)和步骤(7)方法高保真扩增测序与标株相同片段同源性<90％；(5)诊断灵敏度、特异性试验与计算：将合格的若干份临床呼吸道...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘和录，窦宇红，邹享珍，何玥，刘琼，梁鸿，
申请(专利权)人：深圳市宝安区沙井人民医院，刘和录，
类型：发明
国别省市：广东,44