检测Y染色体微缺失的多重PCR引物组、试剂盒和应用制造技术

本发明专利技术涉及基因缺失检测领域，具体涉及一种检测Y染色体微缺失的多重PCR引物组、试剂盒和应用。所述多重PCR引物组包括通用引物和特异性引物，所述通用引物具有如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的碱基序列：其中，SEQ ID NO：1所示碱基序列的5’端标记有荧光基团；所述特异性引物包括具有如SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：22所示碱基序列的引物。本发明专利技术克服了传统多重PCR灵敏度低、非特异性扩增等缺点，通过一套新型的稳定的通用引物‑多重PCR的反应体系结合荧光标记通用引物的方法，扩增产物经毛细管电泳分析，确保了检测的高灵敏度，有效降低了成本，并且可以实现大样本量的高效检测。

Multiplex PCR primer set, kit and application for detecting Y chromosome microdeletion

The invention relates to the field of gene deletion detection, in particular to a multiple PCR primer set, a kit and an application for detecting Y chromosome microdeletion. The multiple PCR primer sets including universal primers and specific primers, the universal primers with nucleotide sequences such as SEQ ID and SEQ NO:1 ID NO:2 shows: the 5 'end labeled SEQ ID NO:1 the base sequence of the fluorophore; the specific primers including primers such as SEQ ID NO:3 ~ SEQ ID NO:22 shown in sequence. The present invention overcomes the shortcomings of traditional multi PCR low sensitivity and nonspecific amplification method, fluorescence labeled universal primers combined with universal primers multiplex PCR reaction system of a new type of stable amplification products by capillary electrophoresis analysis, to ensure the high detection sensitivity, reduces the cost, and can achieve high detection large sample.

【技术实现步骤摘要】
检测Y染色体微缺失的多重PCR引物组、试剂盒和应用
本专利技术涉及基因缺失检测领域，更具体地，涉及一种检测Y染色体微缺失的多重PCR引物组、包括多重PCR引物组的该试剂盒和所述多重PCR引物组及试剂盒作为检测Y染色体微缺失试剂的应用。
技术介绍
根据世界卫生组织(WHO)的研究报告，全世界约有15％的育龄夫妇被不孕(育)症所困扰，其中男性因素约占50％。30％以上男性生不育是由于遗传学因素导致，主要为克氏综合征和Y染色体微缺失。细胞遗传学和分子生物学研究证实位于Y染色体长臂上的无精子因子(azoospermiafactor，AZF)区域的微缺失可以造成生精障碍，导致无精症或严重少精子症。Vogt等人将AZF区分为AZFa、AZFb和AZFc三个亚区，1998年Vogt等人发现AZFb区和AZFc区之间还存在AZFd区。任何一个亚区的微缺失都可能导致生精障碍，而睾丸的病理改变与AZF区微缺失的部位存在明显的相关性。目前检测Y染色体AZF区微缺失已经成为男性无精症或少精症患者的常规检查。AZF区微缺失是否存在，为遗传咨询提供依据，也为临床诊断与后续治疗提供指导。辅助生殖技术的快速发展，尤其是卵细胞胞浆内精子注射(intracytoplasmicsperminjection，ICSI)技术给男性不育患者带来了希望，然而某些类型的Y染色体微缺失患者无法通过自身睾丸取精进行ICSI。另外，ICSI技术的局限性是：有可能将携带有染色体异常或者基因突变等遗传缺陷的精子注入到卵细胞内，卵子受精发育，所携带的遗传缺陷传递给下一代。因此，临床上建议精子浓度＜5×106/mL的男性都要进行Y染色体微缺失的检测。这不仅可以为无精症或少精症患者的遗传咨询提供依据，也为临床诊断与后续治疗提供指导，避免不必要的药物和手术治疗以及遗传缺陷的传递。因此，建立一种简单快速、准确度高且低成本的分子遗传学检测方法对临床具有重要意义。目前Y染色体AZF区微缺失的检测主要是针对Y染色体特定序列标签位点(STS)。根据欧洲男科协会(EAA)和欧洲分子遗传质控网(EMQN)联合发布的《Y染色体微缺失的最佳实践操作指南》(2013年)，推荐采用多重PCR检测AZF区的6个STS(AZFa：sY84，sY86；AZFb：sY127，sY134；AZFc：sY254，sY255)。在此基础上，各个检测实验室可选择性地增加STS的数量进行更精确的检测。目前检测AZF区微缺失的方法包括多重PCR-凝胶电泳法、多重荧光PCR法、芯片杂交法、多重连接探针扩增(MLPA)等多种方法。最常用的是针对序列标签位点(STS)，采用多重PCR扩增-凝胶电泳检测，根据条带的有无对AZF各区的缺失情况做出定性分析。目前该方法已成为检测AZF微缺失的行业“金标准”；但是该方法的检测敏感性不高，凝胶电泳易造成PCR产物污染导致假阳性；每个样本需要3-4组PCR反应，操作繁琐，其检测通量小，不适用于对大样本量的检测。多重荧光PCR方法具有简便、快速、准确的特点，但是探针设计繁琐并且需要报告基团修饰，价格昂贵，不适合临床推广使用。目前，根据上述这两种检测方法，已有多种的Y染色体微缺失检测试剂盒面世。芯片杂交技术也有报道用于检测AZF区微缺失，该方法具有极高的准确度和灵敏度；但是该方法需要设计大量的探针，成本较高，并且其检测、分析也较为复杂，不适合临床医生判读。MRC-Holland公司的MLPA试剂盒(P360Y-Chromosome)通过探针杂交、连接手段分析Y染色体特定区域相对拷贝数，该方法覆盖的范围广、能准确定量分析，但是其结果分析复杂，解读还不完善，目前还只适用于基础研究领域。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的上述缺陷，提供一种检测Y染色体微缺失的多重PCR引物组、包括多重PCR引物组的该试剂盒和所述多重PCR引物组及试剂盒作为检测Y染色体微缺失试剂的应用。本专利技术克服了传统多重PCR灵敏度低、非特异性扩增等缺点，通过一套新型的稳定的通用引物-多重PCR的反应体系结合荧光标记通用引物的方法，扩增产物经毛细管电泳分析，确保了检测的高灵敏度，有效降低了成本，并且可以实现大样本量的高效检测。毛细管的方法具有较高的分辨度和灵敏度，可以检测单个核苷酸的差异，毛细管电泳图清晰直观，易于判读，减少假阴性和假阳性结果率，提高了Y染色体微却缺诊断的准确性。为了实现上述目的，本专利技术提供一种检测Y染色体微缺失的多重PCR引物组，该多重PCR引物组包括通用引物和特异性引物，所述通用引物具有如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的碱基序列：正向Dye-UniversalP-Forward(FAM-UP-F)：5’-GGTGACCAAGTTCATGCTCT-3’(SEQIDNO：1)反向UniversalP-Reverse(UP-R)：5’-GGTCCAGGTCACGAGATCTT-3’(SEQIDNO：2)其中，SEQIDNO：1所示碱基序列的5’端标记有荧光基团Dye；所述特异性引物包括具有如SEQIDNO：3～SEQIDNO：22所示碱基序列的引物。具体如表1所示。所述引物组包括了针对8个STS位点(AZFa：sY84，sY86；AZFb：sY127，sY134；AZFc：sY254，sY255；AZFd：sY145，sY152)和2个内对照(SRY，ZFX/Y)的特异性引物序列和一对通用引物序列。通用引物中正向引物的5’端标记有荧光基团，所述荧光基团为FAM、HEX、VIC、TET、JOE、ROX、TEXAS-RED、CY3、CY5或CY5.5。根据本专利技术，多重PCR引物组中，SEQIDNO：1～SEQIDNO：22的摩尔比优选为(2-20)：(2-20)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)。上述优选比例的各个引物，能够获得更好的检测效果。根据本专利技术的第二方面，本专利技术提供一种检测Y染色体微缺失的试剂盒，该试剂盒包括：如上所述的多重PCR引物组；多重PCR反应试剂。其中，所述多重PCR反应试剂包括但不限于：MgCl2、甜菜碱、热启动Taq酶、dNTPs和PCR反应缓冲液。上述PCR反应试剂，可根据本领域常规方式进行自行配制或通过普通市售获得。根据本专利技术，试剂盒中，所述MgCl2的浓度为50-200mmol/L；所述甜菜碱的浓度为5-20mol/L；所述dNTPs的浓度为5-20mmol/L。使用时，所述MgCl2的终浓度为1.0～5.0mmol/L；所述甜菜碱的终浓度为0.5～2.5mol/L；所述dNTPs的终浓度为50～1000μmol/L。根据本专利技术，优选地，该试剂盒包括：对照DNA标本。进一步优选地，所述DNA标本为正常男性对照标本、AZFa区缺失对照标本、AZFb区缺失对照标本和AZFc区缺失对照标本中的至少一种。优选地，包括上述全部对照DNA标本。根据本专利技术的第三方面，本专利技术还提供上述的多重PCR引物组或上述的试剂盒作为检测Y染色体微缺失试剂的应用。应用本专利技术的多重本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测Y染色体微缺失的多重PCR引物组，其特征在于，该多重PCR引物组包括通用引物和特异性引物，所述通用引物具有如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的碱基序列：正向：5’‑GGTGACCAAGTTCATGCTCT‑3’(SEQ ID NO：1)反向：5’‑GGTCCAGGTCACGAGATCTT‑3’(SEQ ID NO：2)其中，SEQ ID NO：1所示碱基序列的5’端标记有荧光基团；所述特异性引物包括具有如SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：22所示碱基序列的引物。

【技术特征摘要】
1.一种检测Y染色体微缺失的多重PCR引物组，其特征在于，该多重PCR引物组包括通用引物和特异性引物，所述通用引物具有如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的碱基序列：正向：5’-GGTGACCAAGTTCATGCTCT-3’(SEQIDNO：1)反向：5’-GGTCCAGGTCACGAGATCTT-3’(SEQIDNO：2)其中，SEQIDNO：1所示碱基序列的5’端标记有荧光基团；所述特异性引物包括具有如SEQIDNO：3～SEQIDNO：22所示碱基序列的引物。2.根据权利要求1所述的多重PCR引物组，其中，所述荧光基团为FAM、HEX、VIC、TET、JOE、ROX、TEXAS-RED、CY3、CY5或CY5.5。3.根据权利要求2所述的多重PCR引物组，其中，SEQIDNO：1～SEQIDNO：22的摩尔比为(2-20)：(2-20)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5...

【专利技术属性】
技术研发人员：梅世月，孔祥东，白楠，孟静静，
申请(专利权)人：郑州大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：河南,41