基于再生液优化的表面等离子共振技术同时检测多种环境激素的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于再生液优化的表面等离子共振技术同时检测多种环境激素的方法，基于SPR传感器，结合免疫抑制的方法，根据不同抗原抗体间结合力的差异，通过利用不同强度的再生溶液梯度洗脱，结合SPR传感器的实时监控，在单通道的传感芯片表面实现多种环境激素的同时检测。本发明专利技术与现有表面等离子体检测技术相比，检测效率提高了2倍以上，检测成本降低了2倍以上，时间缩短2倍以上，芯片可重复使用几百次，采用本发明专利技术的方法解决了传统SPR单一通道不能多重检测的难题，并且可应用于准确检测双酚A、邻苯二甲酸酯等小分子量(<1000Da)物质。

Method for simultaneous detection of multiple environmental hormones by surface plasmon resonance based on regeneration liquid optimization

The invention discloses a method for simultaneous detection of multiple environmental hormones of surface plasmon resonance technology based on the optimization of regeneration solution, based on the SPR sensor, combined with the method of immune suppression, according to the difference between antigen and antibody binding force, through the use of regenerated solution of different intensity gradient elution, combined with the real-time monitoring of the SPR sensor, detection in various environments the hormone sensor chip surface single channel at the same time. Compared with the existing surface plasma detection technology, the detection efficiency is improved by more than 2 times, the detection cost is reduced by more than 2 times, shorten the time of more than 2 times, the chip can be reused several times, using the method of the invention solves the problem of traditional SPR single channel not multiple detection, and can be applied to the accurate detection of bisphenol A two, phthalic acid ester and other small molecular weight substances (< 1000Da).

【技术实现步骤摘要】
基于再生液优化的表面等离子共振技术同时检测多种环境激素的方法
本专利技术属于检测方法领域，特别是涉及一种基于再生液优化的表面等离子共振技术同时检测多种环境激素的方法。
技术介绍
近些年来，环境激素作为一种生物机体以外的激素类物质，已经被广泛的应用于人们的日常生活中。虽然环境激素给人们带来了一定的经济效益，但是其在环境和食品中的残留严重的影响着人类身体健康。而且，多数环境激素属于持久性有机污染物，很难降解，并具有一定的蓄积毒性，因此，对于环境激素的监控与分析势在必行。目前，环境激素大多是通过高效液相色谱、液相色谱-质谱联用以及酶联免疫法(ELISA)等方法进行检测分析，但是由于仪器操作技术性强、耗时长、样品前处理繁琐、基质成分复杂、ELISA中样品用量浪费以及不能重复使用等缺陷，限制了这些传统方法的应用。因此，需要开发一种更加可靠、高效、灵敏的检测手段。表面等离子共振生物传感器(SurfacePlasmonResonance，SPR)，具有无需标记、高灵敏、快速检测等特点，是环境激素检测的理想工具之一。结合免疫检测技术，利用抗体与抗原的结合的原理，对特定的目标物分子进行定性或者定量分析，而且抗体等蛋白类物质具有较大的分子量，能够引起较高的SPR响应值变化，可以广泛应用于小分子物质(如双酚A、塑化剂等)的环境激素检测。此外，由于环境激素种类繁多，使得传统的检测过程复杂繁琐，单检测通道的SPR传感器无法满足同时检测多种环境激素的要求。因此，迫切需要开发基于SPR技术的新型检测方法。
技术实现思路
针对现有技术中存在的不足，本专利技术提供一种基于再生液优化的表面等离子共振技术同时检测多种环境激素的方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种基于再生液优化的表面等离子共振技术同时检测多种环境激素的方法，包括以下步骤：(1)传感芯片表面包被原或抗体的固定：将各环境激素残留组分的包被原或抗体混合至混合液的体积为50-150μL，所述各包被原或抗体在所述混合液中的浓度均为5-20μg/mL，再利用活化酯法(EDC/NHS)将所述混合液固定在所述传感芯片表面固定；(2)标准溶液配制：用0.01-0.1mol/LpH为6-8的羟乙基哌嗪乙硫磺酸盐缓冲液(HBS缓冲液)配置各残留组分的标准样品储备液，所述标准样品储备液的浓度均为0.1-1mg/mL；量取各标准样品储备液，配制其相应的标准原液；用羟乙基哌嗪乙硫磺酸盐缓冲液将标准原液配制成不同浓度的标准溶液与过量的固定浓度的相应抗体或包被原混合孵化，得到不同浓度的待测物混合液；(3)测试再生液洗脱能力：测试HCl溶液、NaOH溶液、氯化镁溶液和甘氨酸-盐酸溶液对于步骤(1)得到的传感芯片表面各环境激素抗体的洗脱情况，选出各组分的最佳再生条件，并对比其再生液洗脱能力的强弱；(4)建立标准工作曲线：单组分检测：采用表面等离子共振谱传感器测量，通入50-100μL步骤(2)得到的混合液，记录表面等离子体共振传感器的响应信号变化，绘制标准工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得单组分回归曲线的方程；再依次测得其它环境激素的标准工作曲线及单组分回归曲线的方程；多组分同时检测：采用表面等离子共振谱传感器测量，将多种步骤(2)制备的标准溶液与过量的抗体或包被原混合孵化，取孵化后的混合液50-100μL，通入传感器，记录下表面等离子体共振传感器总体的响应信号变化；然后按照步骤(3)的的测试结果，依再生液洗脱能力由弱到强的顺序依次进样洗脱，记录每次残留抗体或包被原的响应值变化；根据不同浓度孵化后的混合液及其相应再生后残留抗体或包被原的响应信号值绘制标准工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得多组分回归曲线方程；(5)定量检测：对于未知含量的含多种环境激素的未知样品进行同时检测，向所述未知样品的待测液中分别加入过量的抗体或包被原，混合孵化后进样，记录总体的响应值变化；按照再生液洗脱能力由弱到强的顺序依次进样洗脱，记录芯片表面每次残留抗体或包被原的响应值变化；将残留抗体或包被原的响应值代入步骤(4)得到的多组分检测的标准工作曲线以及相应的单组分检测标准工作曲线，计算各环境激素的浓度值；依次类推，实现对于环境激素的定量检测；(6)通入0.01-0.02mol/L、pH为1.2-2.5的甘氨酸-盐酸缓冲溶液使芯片再生，再生后的芯片用于下次测量。优选的是，步骤(2)中，所述的pH值为7.4。优选的是，步骤(5)中，标准样品储备液与过量抗体或包被原的混合孵化时间为5-10分钟。在上述方法的步骤(1)中，当传感芯片表面固定的是包被原的混合液时，在后续步骤中进行混合孵化时就采用抗体。反之，在上述方法的步骤(1)中，当传感芯片表面固定的是抗体的混合液时，在后续步骤中进行混合孵化时就采用包被原。通过本专利技术的方法，同一芯片的单通道能够同时连接多种包被原。而且，可以采用不同洗脱强度的再生液对芯片梯度洗脱，同时实现环境激素的检测与芯片再生。根据单一检测曲线方程以及同时检测的曲线方程，可以实现多种环境激素的同时检测。所述步骤(4)和(5)中通入过量的抗体溶液，利用抗体结合芯片的方式，提高表面等离子体共振传感器响应值，适用于测量响应信号较小的小分子量环境激素，其分子量可<1000Da。本专利技术采用SPR传感器梯度再生的方法，将再生液按照由弱到强顺序，梯度洗脱传感器表面吸附的不同结合强度的抗体，基于SPR实时监控的特点，分析再生液洗脱后芯片表面抗体与响应值变化的情况，可同时检测多种环境激素。本专利技术利用免疫抑制的方法，将待测环境激素与过量的抗体预混，混合液中未反应的抗体与传感器芯片表面的包被原发生特异性结合，引起信号变化；若待测样品中目标分子少，则混合液中剩余的未反应的抗体较多，使得芯片表面吸附的抗体多，此时引起的表面等离子体共振响应信号越大，反之则越小。由于抗体的响应值变化可反映出待测目标分子的浓度变化，而抗体的分子量较大，其引起的响应值变化较大，因此，可实现小分子物质的高灵敏检测。而且，当对多种待测环境激素检测时，相应抗体同时结合在芯片表面，通过SPR获得总体的响应值变化；根据不同抗原抗体间结合力的差异，可以通过利用不同强度的洗脱溶液梯度再生的方式，按着再生液由弱到强的顺序进行洗脱，逐一递推，最后通过SPR传感器的实时监控实现多种环境激素的快速和同时检测。本专利技术的优点及有益效果是：1、本专利技术采用免疫抑制的方法，将包被原修饰在芯片表面，大大提高了传感芯片的使用寿命，而且解决了SPR检测小分子量物质的响应值小、灵敏度低等问题，实现了小分子环境激素的高灵敏检测；2、本专利技术采用再生液梯度洗脱的方式，实现了在表面等离子体共振传感器单一检测通道内，同时检测多种环境激素，相比单一物质的检测，大大提高了样品检测效率，缩短了样品检测时间；3、本专利技术不仅能够实现传统单通道SPR传感器多样检测的目的，而且可以进一步提高多通道检测的通量，同时提高了传感芯片的使用效率，降低了环境激素的检测成本。具体实施方式本专利技术通过以下实施例进一步详述。需要说明的是：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本专利技术的保护范围。选择两种典型环境激素为检测对象，分别为双酚A和邻苯二甲酸酯(DEHP)。选择芯片修饰分子为两种目标分子的包被原，即牛血清白蛋白-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于再生液优化的表面等离子共振技术同时检测多种环境激素的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)传感芯片表面包被原或抗体的固定：将各环境激素残留组分的包被原或抗体混合至混合液的体积为50‑150μL，所述各包被原或抗体在所述混合液中的浓度均为5‑20μg/mL，再利用活化酯法将所述混合液固定在所述传感芯片表面固定；(2)标准溶液配制：用0.01‑0.1mol/LpH为6‑8的羟乙基哌嗪乙硫磺酸盐缓冲液配置各残留组分的标准样品储备液，所述标准样品储备液的浓度均为0.1‑1mg/mL；量取各标准样品储备液，配制其相应的标准原液；用羟乙基哌嗪乙硫磺酸盐缓冲液将标准原液配制成不同浓度的标准溶液与过量的固定浓度的相应抗体或包被原混合孵化，得到不同浓度的待测物混合液；(3)测试再生液洗脱能力：测试HCl溶液、NaOH溶液、氯化镁溶液和甘氨酸‑盐酸溶液对于步骤(1)得到的传感芯片表面各环境激素抗体的洗脱情况，选出各组分的最佳再生条件，并对比其再生液洗脱能力的强弱；(4)建立标准工作曲线：单组分检测：采用表面等离子共振谱传感器测量，通入50‑100μL步骤(2)得到的混合液，记录表面等离子体共振传感器的响应信号变化，绘制标准工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得单组分回归曲线的方程；再依次测得其它环境激素的标准工作曲线及单组分回归曲线的方程；多组分同时检测：采用表面等离子共振谱传感器测量，将多种步骤(2)制备的标准溶液与过量的抗体或包被原混合孵化，取孵化后的混合液50‑100μL，通入传感器，记录下表面等离子体共振传感器总体的响应信号变化；然后按照步骤(3)的测试结果，依再生液洗脱能力由弱到强的顺序依次进样洗脱，记录每次残留抗体或包被原的响应值变化；根据不同浓度孵化后的混合液及其相应再生后残留抗体或包被原的响应信号值绘制标准工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得多组分回归曲线方程；(5)定量检测：对于未知含量的含多种环境激素的未知样品进行同时检测，向所述未知样品的待测液中分别加入过量的抗体或包被原，混合孵化后进样，记录总体的响应值变化；按照再生液洗脱能力由弱到强的顺序依次进样洗脱，记录芯片表面每次残留抗体或包被原的响应值变化；将残留抗体或包被原的响应值代入步骤(4)得到的多组分检测的标准工作曲线以及相应的单组分检测标准工作曲线，计算各环境激素的浓度值；依次类推，实现对于环境激素的定量检测；(6)通入0.01‑0.02mol/L、pH为1.2‑2.5的甘氨酸‑盐酸缓冲溶液使芯片再生，再生后的芯片用于下次测量。...

【技术特征摘要】
1.一种基于再生液优化的表面等离子共振技术同时检测多种环境激素的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)传感芯片表面包被原或抗体的固定：将各环境激素残留组分的包被原或抗体混合至混合液的体积为50-150μL，所述各包被原或抗体在所述混合液中的浓度均为5-20μg/mL，再利用活化酯法将所述混合液固定在所述传感芯片表面固定；(2)标准溶液配制：用0.01-0.1mol/LpH为6-8的羟乙基哌嗪乙硫磺酸盐缓冲液配置各残留组分的标准样品储备液，所述标准样品储备液的浓度均为0.1-1mg/mL；量取各标准样品储备液，配制其相应的标准原液；用羟乙基哌嗪乙硫磺酸盐缓冲液将标准原液配制成不同浓度的标准溶液与过量的固定浓度的相应抗体或包被原混合孵化，得到不同浓度的待测物混合液；(3)测试再生液洗脱能力：测试HCl溶液、NaOH溶液、氯化镁溶液和甘氨酸-盐酸溶液对于步骤(1)得到的传感芯片表面各环境激素抗体的洗脱情况，选出各组分的最佳再生条件，并对比其再生液洗脱能力的强弱；(4)建立标准工作曲线：单组分检测：采用表面等离子共振谱传感器测量，通入50-100μL步骤(2)得到的混合液，记录表面等离子体共振传感器的响应信号变化，绘制标准工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得单组分回归曲线的方程；再依次测得其它环境激素的标准工作曲线及单组分回归曲线的方程；多组分同时检测：采...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁利，苏荣欣，夏寅强，齐崴，王利兵，
申请(专利权)人：丁利，苏荣欣，夏寅强，王利兵，齐崴，
类型：发明
国别省市：天津,12