一种基于单个量子点的用于检测DNA甲基转移酶的纳米传感器制造技术

本发明专利技术公开了基于单个量子点的用于检测DNA甲基转移酶的纳米传感器。所述纳米传感器仅涉及单个检测探针，避免了复杂的检测设计和繁琐的信号放大步骤，同时具有对DNA甲基转移酶的高选择性与高灵敏度。所述纳米传感器包括：3'末端生物素化的发夹检测探针，所述检测探针5'末端标记荧光团花菁5(Cy5)，3'末端还标记有猝灭基团黑洞猝灭剂(BHQ2)，茎区包含靶DNA甲基转移酶的识别序列5'‑GATC‑3'；表面包被链霉亲和素的量子点；所述探针通过链霉亲和素‑生物素相互作用连接到链霉亲和素修饰的量子点表面上，形成量子点/探针/花菁5/黑洞猝灭剂复合物；所述纳米传感器还包括甲基化特异性核酸内切酶(DpnI)。

A nano sensor based on a single quantum dot for detecting DNA methyltransferase

A nano sensor based on a single quantum dot for detecting DNA methyltransferase is disclosed. The nano sensor involves only a single detection probe, avoids complicated detection design and tedious signal amplification steps, and has high selectivity and high sensitivity to DNA methyltransferase. The nano sensor includes a hairpin probe for the detection of 3'end biotinylated detection probe, the 5' end labeling fluorescent cyanine Anthocephalus 5 (Cy5), 3'terminal also quencher labeled black hole quencher (BHQ2), stem contains target DNA methylation sequence 5' GATC 3'enzyme; surface by the streptavidin quantum dot element; the probe avidin biotin interaction attached to streptavidin modified on the surface of quantum dots in quantum dots formed by streptavidin, / / probe cyanine 5/ black hole quencher complex; the nano sensor also includes a methylation specific endonuclease (DpnI).

【技术实现步骤摘要】
一种基于单个量子点的用于检测DNA甲基转移酶的纳米传感器
本专利技术属于生物分析
，具体涉及一种基于单个量子点的用于检测DNA甲基转移酶的纳米传感器。
技术介绍
DNA甲基化是细胞中主要的表观遗传修饰，在各种重要细胞过程中起关键作用，如基因调控，染色质结构维持和细胞发育。DNA甲基化由DNA甲基转移酶(MTases)家族催化。通过将甲基从S-腺苷甲硫氨酸(SAM)转移到特定DNA序列中的腺嘌呤或胞嘧啶残基，DNA甲基转移酶可以建立和维持一定的基因组甲基化模式。异常的DNA甲基转移酶活性可能会干扰正常的甲基化模式，导致包括癌症在内的许多疾病的发生。例如，DNA甲基转移酶(1,3a和3b)的过表达与视网膜母细胞瘤的肿瘤发生密切相关。胞嘧啶DNA甲基转移酶的活性在结肠癌进展期间增加。在非小细胞肺癌中DNA甲基转移酶-1的表达升高。此外，通过特异性抑制剂抑制DNA甲基转移酶活性为人类癌症的治疗提供了新的机会。因此，DNA甲基转移酶的准确检测以及抑制剂的筛选对于疾病诊断和治疗至关重要。目前，DNA甲基转移酶检测的标准方法是基于其辅因子的放射性标记([甲基-3氢]-S-腺苷甲硫氨酸)，然而放射性物质的参与大大限制了该方法的广泛应用。为了避免放射性污染，已经开发了非放射性高效液相色谱(HPLC)测定法，但是该方法过程繁琐，耗时多。最近，建立了各种新方法，包括比色法，化学发光法，荧光法，电化学法等。虽然这些方法为DNA甲基转移酶的定量检测提供了有效的平台，但是它们仍然不足以灵敏的检测非常低丰度的靶标。为了提高检测的灵敏度，已经引入了几种信号扩增方法用于DNA甲基转移酶的检测，例如核酸外切酶III辅助的靶循环，核酸内切酶辅助的扩增，双链特异性核酸酶辅助扩增，滚环扩增(RCA)和链置换扩增(SDA)。在这些方法中，DNA甲基转移酶的检测限已大大改善，然而，它们需要繁琐的多重探针和扩增模板来完成信号扩增步骤，并且由于非特异性扩增经常产生高背景信号。与传统的荧光蛋白和有机染料相比，半导体量子点具有光稳定性好，量子产量高，宽激发，窄发射的独特光学特性，已经广泛应用于生物成像和生物传感领域。然而迄今为止，鲜有通过整合单分子荧光检测和量子点技术用于检测DNA甲基转移酶的报道。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，本专利技术提出一种基于单量子点的纳米传感器，所述纳米传感器仅涉及单个检测探针，避免了复杂的检测设计和繁琐的信号放大步骤，同时具有对DNA甲基转移酶的高选择性与高灵敏度。具体的，本专利技术涉及以下技术方案：首先，本专利技术提供一种基于单量子点的纳米传感器，所述纳米传感器包括：3'末端生物素化的发夹检测探针，所述检测探针5'末端标记荧光团花菁5(Cy5)，3'末端还标记有猝灭基团黑洞猝灭剂(BHQ2)，茎区包含靶DNA甲基转移酶的识别序列5'-GATC-3'；表面包被链霉亲和素的量子点；所述探针通过链霉亲和素-生物素相互作用连接到链霉亲和素修饰的量子点表面上，形成量子点/探针/花菁5/黑洞猝灭剂复合物；所述纳米传感器还包括甲基化特异性核酸内切酶(DpnI)。本专利技术所述的纳米传感器，依靠量子点/探针/花菁5/黑洞猝灭剂复合物中Cy5与量子点的荧光共振能量转移，对于荧光分子Cy5的选择，虽然现有技术已有多种可与量子点发生荧光共振能量转移的荧光染料分子，如TAMRA/Cy3/TexasRed/罗丹明等，但专利技术人通过对比试验研究发现，QD/Cy5这一对组合在本专利技术所述方法中的荧光共振能量转移(FRET)效率更高。优选的，所述发夹检测探针长度为36nt，所述发夹检测探针的碱基序列为：5'-blackholequencher2(BHQ2)-ACAGTGATCATTGTTTTCAATGATCACTGT-Cy5-TTTTTT-Biotin-3'；优选的，本专利技术所述量子点为605QDs；本专利技术所述605QDs是指从公司InvitrogenCorporation(California,U.S.A.)购买得到的Qdot605ITK，它是一种streptavidin-coatedCdSe/ZnSQDs，最大发射波长为605nm。优选的，所述纳米传感器还包括S-腺苷甲硫氨酸和甲基化特异性核酸内切酶反应缓冲溶液；进一步优选的，所述甲基化特异性核酸内切酶反应缓冲溶液组成为：50毫摩尔每升的醋酸钾，20毫摩尔每升的三羟甲基氨基甲烷-醋酸，10毫摩尔每升的醋酸镁，100微克每毫升的牛血清白蛋白，pH7.9。本专利技术还公开了所述纳米传感器用于检测DNA甲基转移酶的方法，具体方法如下：(1)将待测样品加入所述生物素化的发夹检测探针溶液中进行反应，反应结束后进行高温失活；(2)向步骤(1)中加入表面包被链霉亲和素的量子点进行孵育反应；(3)采用全内角反射荧光技术(TIRF)的单分子成像系统对Cy5的荧光信号进行检测，以定量检测待测样品中的DNA甲基转移酶。优选的，所述步骤(1)中反应温度为30-40℃(最佳为37℃)，反应时间为1h；高温失活反应温度为70-90℃(最佳为80℃)，反应时间为20分钟；优选的，所述步骤(2)中孵育反应温度为室温(20℃)，反应时间为10min。本专利技术还公开了上述纳米传感器和/或检测方法在检测DNA甲基转移酶活性和/或筛选DNA甲基转移酶抑制剂中的应用。本专利技术所述纳米传感器检测方法的原理为：本专利技术技术方案首先设计了一个生物素化的发夹检测探针，其5'末端标记荧光团花菁5(Cy5)，3'末端标记猝灭基团黑洞猝灭剂(BHQ2)，茎区包含靶DNA甲基转移酶的识别序列5'-GATC-3'。探针通过链霉亲和素-生物素相互作用连接到链霉亲和素修饰的量子点表面上，形成量子点/探针/花菁5/黑洞猝灭剂复合物。在该复合物中，由于量子点和花菁5可忽略的发射串扰以及量子点的发射和花菁5激发之间的显着光谱重叠，量子点用作荧光共振能量转移的供体，且花菁5用作荧光共振能量转移的受体。理论上，DNA中相邻碱基之间的距离约为0.34nm，链霉亲和素修饰的量子点的最大半径为7.5nm。量子点/探针/花菁5/黑洞猝灭剂复合物中的量子点与花菁5之间的距离计算为9.2nm，且在荧光共振能量转移的范围内(对于量子点/花菁5，2R0＝14nm)。因此，量子点/探针/花菁5/黑洞猝灭剂纳米结构中的量子点和花菁5之间可能发生有效的荧光共振能量转移，产生明显的花菁5发射，然而，花菁5的发射被附近的黑洞猝灭剂完全淬灭。当靶DNA甲基转移酶存在时，DNA甲基转移酶将催化识别序列5'-GATC-3'的甲基化，产生甲基化产物5'-GAmTC-3'。随后，限制性核酸内切酶(DpnI)可以切割甲基化的探针，导致黑洞猝灭剂部分从量子点/探针/花菁5/黑洞猝灭剂复合物中释放。因此，花菁5的发射恢复。最后，通过计算基于全内反射荧光成像的花菁5的光子，可以定量检测靶DNA甲基转移酶。本专利技术的有益效果：1.本专利技术制备得到的纳米传感器用于检测DNA甲基转移酶时，当靶DNA甲基化酶Dam的存在时，检测探针被特异性甲基化，随后被甲基化限制性核酸内切酶DpnI切割，导致黑洞猝灭剂BHQ2从检测探针中释放。因此，来自荧光共振能量转移的Cy5的发射恢复，并且可以通过基于全内反射荧光(TIRF)成像的单分子计数检测。整个过本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于单量子点的纳米传感器，其特征在于，所述纳米传感器包括：3'末端生物素化的发夹检测探针，所述检测探针5'末端标记荧光团花菁5(Cy5)，3'末端还标记有猝灭基团黑洞猝灭剂(BHQ2)，茎区包含靶DNA甲基转移酶的识别序列5'‑GATC‑3'；表面包被链霉亲和素的量子点；所述探针通过链霉亲和素‑生物素相互作用连接到链霉亲和素修饰的量子点表面上，形成量子点/探针/花菁5/黑洞猝灭剂复合物；所述纳米传感器还包括甲基化特异性核酸内切酶DpnI。

【技术特征摘要】
1.一种基于单量子点的纳米传感器，其特征在于，所述纳米传感器包括：3'末端生物素化的发夹检测探针，所述检测探针5'末端标记荧光团花菁5(Cy5)，3'末端还标记有猝灭基团黑洞猝灭剂(BHQ2)，茎区包含靶DNA甲基转移酶的识别序列5'-GATC-3'；表面包被链霉亲和素的量子点；所述探针通过链霉亲和素-生物素相互作用连接到链霉亲和素修饰的量子点表面上，形成量子点/探针/花菁5/黑洞猝灭剂复合物；所述纳米传感器还包括甲基化特异性核酸内切酶DpnI。2.如权利要求1所述的基于单量子点的纳米传感器，其特征在于，所述发夹检测探针长度为36nt，所述发夹检测探针的碱基序列为：5'-blackholequencher2(BHQ2)-ACAGTGATCATTGTTTTCAATGATCACTGT-Cy5-TTTTTT-Biotin-3'。3.如权利要求1所述的基于单量子点的纳米传感器，其特征在于，所述量子点为605QDs。4.如权利要求1所述的基于单量子点的纳米传感器，其特征在于，所述纳米传感器还包括S-腺苷甲硫氨酸和甲基化特异性核酸内切酶反应缓冲溶液。5.如权利要求4所述的基于单量子点的纳米传感器，其特征在于，所述甲基化特异性核酸内切酶反应缓...

【专利技术属性】
技术研发人员：张春阳，马飞，刘文静，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东,37