一种兔支气管败血波氏杆菌的检测方法技术

本发明专利技术提供一种用于兔支气管败血波氏杆菌的悬浮荧光免疫检测方法，包括有用于检测兔支气管败血波氏杆菌的悬浮荧光免疫检测试剂盒及其间接悬浮免疫荧光检测方法。其中，试剂盒成份包括用于检测兔支气管败血波氏杆菌的单因子血清抗体、FITC标记羊抗小鼠IgG、阳性对照样品、固定液和PBS洗液；所述的检测兔支气管败血波氏杆菌的单因子血清抗体，是用兔支气管败血波氏杆菌QDBb01株外膜蛋白抗原免疫小鼠制备的。以此试剂盒为基础构建的兔支气管败血波氏杆菌悬浮荧光免疫检测方法，可检测临床上兔支气管败血波氏杆菌感染兔病料组织中的抗原，判定是否感染兔支气管败血波氏杆菌，其特异性强、灵敏度高、可重复性好且检测速度快。

Detection method of a rabbit Bordetella bronchiseptica

The present invention provides a method for suspension fluorescence immunoassay for detection of Bordetella bronchiseptica, including for detection of Bordetella bronchiseptica suspension immunofluorescence assay kit and indirect immunofluorescence method to detect suspension. The kit component includes means for detecting Bordetella bronchiseptica serum antibody and FITC labeled Goat anti mouse IgG, positive control samples, fixed solution and PBS solution; single factor serum antibody and the detection of Bordetella bronchiseptica, with rabbit Bordetella bronchiseptica strain was QDBb01 mice immunized with antigen preparation. This kit for rabbit Bordetella bronchiseptica suspension fluorescence immunoassay method based on clinical, detection of Bordetella bronchiseptica infection infected rabbits in tissue antigen, to determine whether the infection of Bordetella bronchiseptica, its strong specificity, high sensitivity, good repeatability and speed of detection fast.

【技术实现步骤摘要】
一种兔支气管败血波氏杆菌的检测方法
本专利技术属于家畜病毒检测
，具体涉及一种兔支气管败血波氏杆菌的检测方法。
技术介绍
兔支气管败血波氏杆菌病在秋冬季节和早春多发；该菌主要通过空气传播，经呼吸道而感染。幼兔发病率高，并且有死亡病例。成年兔发病较少。此菌在群养兔污染为64.4％，散养兔为20％。在自然条件下，多种哺乳动物上呼吸道中都有本菌寄生，常引起慢性呼吸道病的相互感染。尤其在天气突变，兔的抵抗力下降，兔舍卫生不好，空气污浊等情况下，均可引起本病发生。本病的潜伏期7～10d。成年兔表现鼻炎和支气管炎。有多量的浆液性、黏液性鼻液流出。鼻炎长期不愈，鼻腔流出黏液性或脓性分泌物，打喷嚏，呼吸困难，不食，消瘦等。仔兔多呈急性经过，初期刚见鼻炎病状后，即表现呼吸困难，迅速死亡，病程2～3d。本病的主要病变为鼻炎、化脓性鼻气管炎、化脓性支气管肺炎，个别的出现败血病变化。鼻腔、气管黏膜充血、水肿。鼻腔内有浆液性、黏液性或黏液脓性分泌物。在肺门支气管周围到肺的边缘见有支气管肺炎病灶。病变多见于心叶、尖叶，严重的病例，波及全肺叶。病变部隆起、坚硬，呈暗红色，褐色，进而为灰黄色。有些病例肺上有大小不等的脓疮。严重的占肺部的90％以上。有的肝脏表面有黄豆至蚕豆大的脓疮。脓疮破后可见黏稠的奶油状乳白色的脓汁。还见有心包炎、胸膜炎、胸腔积脓及肌肉脓肿等。根据临床病状及剖检变化可初步确诊。但必须进行细菌学检查，找出病原才能最后确诊。采取呼吸道分泌物或病变组织涂片，革兰氏染色，镜检，能看到革兰氏阴性、小球杆菌；如用美蓝染色，镜检，可见多形态、两极染色的小杆菌。血清学检查可用平板凝集试验，在洁净的玻片上，滴加1滴菌液(2500亿菌1ml)，再加1滴被检血清，充分混合，在20～25℃条件下作用2～5min，出现颗粒絮状物，液体清亮为阳性。以上检测方法均不能进行对分离到的病原菌直接定性，往往存在同种类分离菌的影响，不能精确确诊，易出现误诊。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种兔支气管败血波氏杆菌的检测方法，可以更灵敏、更特异的检测到兔体是否感染了兔支气管败血波氏杆菌，从而弥补现有技术的不足。本专利技术首先提供一种用于检测兔支气管败血波氏杆菌的试剂盒，包含如下的组分：1)一抗：用于检测兔支气管败血波氏杆菌的单因子血清抗体；2)二抗：FITC标记的山羊抗小鼠IgG；3)阳性对照样品：兔支气管败血波氏杆菌；4)PBS洗液:Nacl8.0g/L；Kcl0.2g/L；Na2HPO43.58g/L；KH2PO40.24g/L定容至1L。其中单因子血清抗体，其制备方法如下：将兔支气管败血波氏杆菌QDBb01株(RabbitBordetellabronchisepticaQDBb01)，保藏编号为CCTCCNO:M2016607；进行培养，并4000r/min收集菌体，再用PH7.2的Tris-Hcl溶液重悬菌体，将重悬菌体超声波破碎，破碎工作1s，间隔时间3s，全程时间12min，总共180次；再4000r/min低速离心去除未破碎掉的细菌菌体和较重的细菌细胞内细胞器，取上清液于100000r/min，超速离心20min，去上清；将含外膜蛋白的沉淀用含2％TritonX-100的Tris-Hcl缓冲液溶解，室温下孵育1h去除内膜蛋白，再进行100000r/min超速离心30min，沉淀用缓冲液再重悬，采用能够截留蛋白分子量在40kDa以上的半透膜透析掉小分子外膜蛋白；将纯化后的兔支气管败血波氏杆菌外膜蛋白浓度稀释至50μg/ml，再与弗氏完全佐剂按照体积比1:1乳化制备亚单位疫苗，将此疫苗三次强化免疫Balb/C小鼠，每次间隔14d后，用兔支气管败血波氏杆菌进行攻毒，选择攻毒后无发病临床症状的健康小鼠采集血清制备成单因子血清抗体。上述的试剂盒用于检测兔支气管败血波氏杆菌；操作步骤包括如下：通过将待检测的样品菌进行3％TSB培养基培养后，先收集细胞于离心管中，1500r/min离心收集细菌，并用PBS重悬洗涤收集菌，然后加入10％多聚甲醛对重悬菌体固定、1％BSA封闭，再依次加入试剂盒中制备的一抗(兔支气管败血波氏杆菌单因子血清)、二抗(FITC标记的山羊抗小鼠IgG)赋育，以上操作步骤均采用1500r/min离心10min的方法进行洗涤多聚甲醛以及未结合的BSA、一抗和二抗，最后将染色后的细菌液滴至载玻片上，并用盖玻片封片，于荧光显微镜下观察。为了弥补现今国内外兔支气管败血波氏杆菌悬浮培养后检测方法的不足，本专利技术通过构建兔支气管败血波氏杆菌悬浮荧光免疫检测试剂盒，将待检兔支气管败血波氏杆菌悬浮培养后，采用间接免疫荧光检测技术(IFA)进行该菌悬浮状态下的一抗、二抗荧光抗体染色。该检测方法能够具体检测到兔支气管败血波氏杆菌的单个菌体(出现特异性绿色荧光)，具有灵敏度高、特异性强和重复性好的特点。具体实施方式实施例1：用于检测兔支气管败血波氏杆菌的悬浮荧光免疫试剂盒的构建1.1针对兔支气管败血波氏杆菌单因子血清抗体的制备方法用于检测兔支气管败血波氏杆菌的荧光免疫试剂盒主要成分为鼠抗兔支气管败血波氏杆菌外模蛋白的单因子血清抗体，是将青岛易邦生物工程有限公司技术中心分离鉴定保存的兔支气管败血波氏杆菌QDBb01株(于2016年11月1日保藏在中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2016607)进行3％TSB培养，并4000r/min收集菌体，再用PH7.2Tris-Hcl重悬菌体，将重悬菌体超声波破碎，工作1s，间隔时间3s，全程时间12min，总共180次。4000r/min低速离心去除未破碎掉的细菌菌体和较重的细菌细胞内细胞器，取上清液于100000r/min，超速离心20min，去上清。将含外膜蛋白的沉淀用含2％TritonX-100的Tris-Hcl缓冲液溶解，室温下孵育1h去除内膜蛋白，再进行100000r/min超速离心30min，沉淀用缓冲液再重悬，采用能够截留蛋白分子量在40kDa以上的半透膜透析掉小分子外膜蛋白，分装，置-20℃保存。采用Bradford蛋白含量测定法测出样品中纯化的兔支气管败血波氏杆菌外膜蛋白浓度。将纯化后的兔支气管败血波氏杆菌外膜蛋白浓度稀释至50ug/ml，再与弗氏完全佐剂按照体积比1:1乳化制备亚单位疫苗，将此疫苗三次强化免疫10只Balb/C小鼠，每只1ml(25ug/只)；14d后用进行第二次免疫，1ml/只；再经14d后第三次免疫(方法同第二次)，其中5只未免疫Balb/C小鼠作为阴性对照组。第三次免疫后10d，，用兔支气管败血波氏杆菌P13株(进行攻毒的兔支气管败血波氏杆菌还可以选用其它兔支气管败血波氏杆菌)进行攻毒，选择攻毒后发病临床症状的健康小鼠采集血清制备，析出的血清-20℃保存。其制备出的抗体能够与兔支气管败血波氏杆菌外膜蛋白发生特异性反应。以此单因子血清构建的兔支气管败血波氏杆菌的荧光免疫检测试剂盒，可以检测兔支气管败血波氏杆菌的外膜抗原蛋白，可以检测临床上兔支气管败血波氏杆菌感染兔病料组织中的抗原，判定是否感染图支气管败血波氏杆菌，其特异性强、灵敏度高、可重复性好且检测速度快，与以往的PCR、革兰氏染色、平板凝集试验及动物回归试验检测方法相比，利用该试剂盒通过IFA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测兔支气管败血波氏杆菌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含如下的组分：1)一抗：用于检测兔支气管败血波氏杆菌的单因子血清抗体；2)二抗：FITC标记的山羊抗小鼠IgG；3)PBS洗液；其配比为Nacl 8.0g/L；Kcl 0.2g/L；Na2HPO4 3.58g/L；KH2PO4 0.24g/L。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测兔支气管败血波氏杆菌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含如下的组分：1)一抗：用于检测兔支气管败血波氏杆菌的单因子血清抗体；2)二抗：FITC标记的山羊抗小鼠IgG；3)PBS洗液；其配比为Nacl8.0g/L；Kcl0.2g/L；Na2HPO43.58g/L；KH2PO40.24g/L。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的单因子血清抗体，其制备方法如下：将兔支气管败血波氏杆菌进行培养，并4000r/min收集菌体，再用PH7.2的Tris-Hcl溶液重悬菌体，将重悬菌体超声波破碎，破碎工作1s，间隔时间3s，全程时间12min，总共180次；再4000r/min低速离心去除未破碎掉的细菌菌体和较重的细菌细胞内细胞器，取上清液于100000r/min，超速离心20min，去上清；将含外膜蛋白的沉淀用含2％TritonX-100的Tris-Hcl缓冲液溶解，室温下孵育1h去除内膜蛋白，再进行100000r/min超速离心30min，沉淀用缓冲液再重悬，采用能够截留蛋白分子量在40kDa以上的半透膜透析掉小分子外膜蛋白；将纯化后的兔支气管败血波氏杆菌外膜蛋白浓度稀释至50μg/ml，再与弗氏完全佐剂按照体积比1:1乳化制备亚单位疫苗，将此疫苗三次强化免疫Balb/C小鼠，每次...

【专利技术属性】
技术研发人员：张恒，郭莉莉，张会，范根成，杜元钊，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37