测定人体血清视黄醇结合蛋白含量的试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术提供测定人体血清视黄醇结合蛋白含量的试剂盒及其制备方法。试剂R1和试剂R2按体积比为3:1组成，R1：0.01％～4％w/w的乳化剂、0.1％～2％w/w氯化钠、0.05％～2％w/w的增敏剂、0.02％w/w的防腐剂、30～100mmol/L的缓冲液。R2：0.1％～0.5％w/w结合有抗人视黄醇结合蛋白抗体的胶乳微粒、0.1％～1.0％w/w牛血清白蛋白、0.02％～2％w/w吐温20、0.02％～2％w/w稳定剂2、0.02％～2％w/w蛋白保护剂2、0.02％w/w防腐剂、20～50mmol/L缓冲液。本发明专利技术试剂盒线性范围广、灵敏度和稳定性好，有较好的临床应用前景。

【技术实现步骤摘要】
测定人体血清视黄醇结合蛋白含量的试剂盒及其制备方法
本专利技术涉及生物试剂，具体涉及检测试剂盒，尤其涉及一种稳定的胶乳免疫比浊法测定人体血清视黄醇结合蛋白含量的试剂盒及其制备方法。
技术介绍
视黄醇结合蛋白(Retinolbindingprotein，RBP)是一种单一肽链的蛋白质，含183个氨基酸残基，相对分子量约为21000，半衰期约为3～12小时，属于Lipocalin蛋白超家族成员。RBP是血液中视黄醇(维生素A)的转运蛋白，由肝脏合成、广泛分布于血液、脑脊液、尿液及其他体液中，其主要功能是将视黄醇(维生素A)从肝细胞转运到上皮细胞。现认为血液中RBP主要以和视黄醇、前白蛋白结合的复合物形式存在，当复合物中视黄醇与靶细胞结合之后，RBP便于前白蛋白分离，自肾小球滤出，由近端肾小管上皮细胞吸收、降解。近年来的深入研究表明RBP含量改变能够灵敏地反映出近端肾小管功能和损害程度，同时RBP由肝细胞合成，当肝细胞损伤时，RBP合成受抑制，故检测血液RBP水平，可敏感地反映肝功能的改变。另外，维生素A缺乏症、吸收不良综合征等营养性疾病会引起血液RBP含量的降低，因此RBP含量的变化是反映肾脏、肝脏及营养性疾病发展的一项指标，在临床早期诊断和疗效观察中具有重要意义。检测血清或尿液中RBP的主要方法为免疫法，最早采用单向免疫扩散法(RID)及酶免疫测定法(EIA)对RBP含量进行测定，而这两种方法不仅费时，检测限也较差。而更灵敏的放射、荧光酶免疫测定的方法能改善RBP测定的可靠性，但对仪器设备要求高，测定时间仍较长，无法常规应用，更无法用于急诊测定。同时，以上各种测定方法均属非均相测定方法，对仪器自动化程度要求较高，因此限制了RBP含量测定在临床的广泛应用。近年来，快速发展的颗粒增强透射免疫比浊法(PETIA)可以稳定、快速、准确地测定视黄醇结合蛋白浓度的检测方法，是一种胶乳均相免疫的测定方法，即在胶乳颗粒上包被抗体，与抗原结合时颗粒发生凝集，改变反应液的透光性能，此方法易于自动化，但该方法检测试剂盒的稳定性、分析灵敏度和线性范围还有待进一步提高。目前，胶乳免疫比浊法常用载体为聚苯乙烯纳米微球，通常为羧基化、氨基化的微粒。表面修饰的胶乳微球与抗体的结合主要是以氨基、羧基形成共价键结合的，这种结合有效地为抗体与抗原的免疫结合提供了合适的三维空间结构。但临床检测要求试剂盒能够同时满足特异性强、灵敏度高、抗干扰强、线性范围宽、开瓶稳定性好等，因而这些技术问题需要进一步深入研究。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，提高试剂的稳定性，检测的分析灵敏度和检测范围；研究设计一种灵敏度高，特异性好，精密度好，准确度高的测定视黄醇结合蛋白测定试剂盒。本专利技术提供一种测定人体血清视黄醇结合蛋白含量的试剂盒。本专利技术试剂盒由试剂R1和试剂R2组成。所述试剂R1和试剂R2的体积比为3:1。本专利技术试剂盒所述试剂R1由下列百分配比的组分组成：0.01％～4％(w/w)的乳化剂、0.1％～2％(w/w)氯化钠、0.05％～2％(w/w)的增敏剂、0.02％(w/w)的防腐剂、30～100mmol/L的缓冲液。所述试剂R1为抗体抗原特异性结合的反应促进液。所述试剂R1所述乳化剂选自吐温20、吐温80或聚乙二醇辛基苯基醚。所述增敏剂选自聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000或聚乙二醇20000，优选为聚乙二醇20000。增敏剂主要作用于抗体抗原的反应速率。所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液(PBS)、三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris)、3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液(Mops)、2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液(MES)、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液或羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中的一种或多种；所述缓冲液pH值为6～9。本专利技术试剂盒所述试剂R2由下列百分配比的组分组成：0.1％～0.5％(w/w)结合有抗人视黄醇结合蛋白抗体的胶乳微粒、0.1％～1.0％(w/w)牛血清白蛋白、0.02％～2％(w/w)吐温20、0.02％～2％(w/w)稳定剂2、0.02％～2％(w/w)蛋白保护剂2、0.02％(w/w)防腐剂、20～50mmol/L缓冲液。所述结合有抗人视黄醇结合蛋白抗体的胶乳微粒为：选择不同粒径的羧基化聚苯乙烯胶乳微粒与抗人视黄醇结合蛋白抗体形成的复合物。所述不同粒径的纳米胶乳微粒的直径在50～250nm。所述的抗人视黄醇结合蛋白抗体选自兔抗人多克隆抗体、羊抗人克隆抗体或兔抗人多克隆抗体与羊抗人多克隆抗体的混合物。所述试剂R2的稳定剂2和蛋白保护剂2，可以提高试剂的稳定性，所述稳定剂2为聚氧乙烯树脂类,选自聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯或月桂醇聚氧乙烯醚硫酸酯钠盐，蛋白保护剂2为海藻糖。所述试剂R2的缓冲液选自磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、2-吗啉乙横酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液或羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中的一种或多种；所述缓冲液pH值为6～9。所述试剂R2的防腐剂选自叠氮化钠、N-甲基-异噻唑酮、N'-亚甲基-双[N'-(3-羟甲基-2,5-二酮-4-咪唑烷基)]脲或ProClin300中的一种或多种。其中ProClin300为2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮的混合溶液，ProClin300为商品名。本专利技术的原理为：本专利技术使用结合有抗体的胶乳微粒偶联物，与相应样本中的抗原发生免疫反应后形成聚集，改变体系的浊度，在一定的波长下，通过测定反应前后浊度的变化，即可测出样本中被检测物质的含量。本专利技术的另一目的是提供了所述测定人体血清视黄醇结合蛋白含量的试剂盒的制备方法。该方法包括下列步骤：Ⅰ、制备试剂R1：取1L水，然后依次加入氯化钠、增敏剂、乳化剂、防腐剂，每次添加物料需要搅拌至完全溶解，调节pH值至6.0～9.0，优选7.4，然后过0.22μm滤膜得到试剂R1；Ⅱ、制备试剂R2：(1)聚苯乙烯胶乳微粒的活化：在带有羧基的聚苯乙烯胶乳微粒中加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDAC)，混合均匀后室温(25-30℃)活化30min；(2)抗人视黄醇结合蛋白抗体与聚苯乙烯胶乳微粒的偶联：将步骤(1)中活化的聚苯乙烯胶乳微粒和抗人视黄醇结合蛋白抗体混合后，于室温(25-30℃)反应2h进行共价偶联；(3)结合有抗人视黄醇结合蛋白抗体的胶乳微粒复合物的洗涤：将结合有抗人视黄醇结合蛋白抗体的胶乳微粒的反应液于切向流过滤系统中进行过滤洗涤，除去游离抗体、小分子杂质，洗涤液为50～100mM缓冲液(pH7.0～8.0)，得到洗涤后的结合有抗人视黄醇结合蛋白抗体的胶乳微粒；(4)结合有抗人视黄醇结合蛋白抗体的胶乳微粒的封闭与保存：将步骤(3)得到的洗涤后的结合有抗人视黄醇结合蛋白抗体的胶乳微粒中加入聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯和海藻糖，封闭聚苯乙烯胶乳微粒上未反应的基团及其他吸附位点，封闭1h后稀释3-6倍得到第一种粒径的的初反应液；(5)制备另一粒径的结合有抗人视黄醇结合蛋白抗体的胶乳微粒：制备方法同上述步骤(1)-(4)；(6)步骤(4)得到的第一种粒径的初反应液与步骤(5)得到的第二种粒径的初反应液按20～80:100比例进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
测定人体血清视黄醇结合蛋白含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由试剂R1和试剂R2按体积比为3:1组成。

【技术特征摘要】
1.测定人体血清视黄醇结合蛋白含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由试剂R1和试剂R2按体积比为3:1组成。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1由下列百分配比的组分组成：0.01％～4％w/w的乳化剂、0.1％～2％w/w氯化钠、0.05％～2％w/w的增敏剂、0.02％w/w的防腐剂、30～100mmol/L的缓冲液。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1乳化剂选自吐温20、吐温80或聚乙二醇辛基苯基醚；所述增敏剂选自聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000或聚乙二醇20000，优选为聚乙二醇20000；所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液、2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液或羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中的一种或多种；所述缓冲液pH值为6～9。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R2由下列百分配比的组分组成：0.1％～0.5％w/w结合有抗人视黄醇结合蛋白抗体的胶乳微粒、0.1％～1.0％w/w牛血清白蛋白、0.02％～2％w/w吐温20、0.02％～2％w/w稳定剂2、0.02％～2％w/w蛋白保护剂2、0.02％w/w防腐剂、20～50mmol/L缓冲液。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，试剂R2所述结合有抗人视黄醇结合蛋白抗体的胶乳微粒为：选自不同粒径的羧基化聚苯乙烯胶乳微粒与抗人视黄醇结合蛋白抗体形成的复合物；所述不同粒径的纳米胶乳微粒的直径在50～250nm。6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，试剂R2所述的抗人视黄醇结合蛋白抗体选自兔抗人多克隆抗体、羊抗人克隆抗体或兔抗人多克隆抗体与羊抗人多克隆抗体的混合物。7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，试剂R2所述稳定剂2为聚氧乙烯树脂类,选自聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯或月桂醇聚氧乙烯醚硫酸酯钠盐；蛋白保护剂2为海藻糖。8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，试剂R2所述的缓冲液选自磷酸盐缓冲液、三羟甲基...

【专利技术属性】
技术研发人员：张龙平，景盛，
申请(专利权)人：上海复星长征医学科学有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31