一种胸苷激酶1磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种胸苷激酶1磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法，该试剂盒包含试剂A、试剂B和胸苷激酶1(TK1)校准品，其中试剂A为包被有抗胸苷激酶1(TK1)抗体的磁微粒混悬液，试剂B为碱性磷酸酶标记的抗胸苷激酶1(TK1)抗体酶结合物试剂。与现有技术相比，本发明专利技术提供了一种测定胸苷激酶1(TK1)含量的方法，利用本发明专利技术提供的试剂盒，根据双抗体夹心法的原理可以准确、灵敏、快速地测定样本中胸苷激酶1(TK1)的含量。

A magnetic particle chemiluminescence kit for the determination of thymidine kinase 1 and its preparation

【技术实现步骤摘要】
一种胸苷激酶1磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法
本专利技术涉及生物试剂，具体涉及检测试剂盒，尤其涉及一种灵敏度高、特异性强的测定人体血清胸苷激酶1含量的试剂盒及其制备方法。
技术介绍
胸苷激酶1(ThymidineKinase1，TK1)胸苷激酶(TK1)是DNA合成中的关键酶之一，在镁离子和ATP的参与的条件下，可催化胸腺嘧啶核苷(TdR)转化为脱氧胸苷一磷酸(TMP)，进而形成的胸苷三磷酸(TTP，DNA合成中的四种必须脱氧核苷酸之一)从而参与DNA合成。TK1水平的升高和DNA的合成成正相关，在细胞周期中，TK1在G1期晚期开始升高，于S期达到最高，至G2期开始下降，由于TK1与细胞周期S期的特殊相关性，又被称为“S期关键酶”，是通过补救途径在S期合成DNA的关键酶。TK1通常有两种形式，其TK1全酶是分子量约为12KDa的四聚体，同时也有二聚体形式。通常四聚体的催化效率更高，约为二聚体的22倍。在ATP存在的情况下，TK1更倾向于形成四聚体，去除ATP则回复二聚体的形式，该过程可逆。TK1在组织或细胞萃取液中并不稳定，但是血清中较为稳定，-20℃条件下保存期较长。在临床研究中，TK1浓度和活性的显著相关性仅存在于健康人、良性肿瘤患者和部分恶性肿瘤患者中(如白血病、乳腺癌、胃癌)。通常90-95％的恶性肿瘤患者TK1的浓度会高于正常人，但是相对应的TK1活性却只有该增幅的75％。因此在恶性实体肿瘤的检测中用TK1浓度作为肿瘤标志物可能比检测TK1活性灵敏度更高，而在乳腺癌、前列腺癌的早期发展中检测TK1蛋白浓度也比检测TK1活性更有效。与此同时，TK1还和一些实体肿瘤(如肺癌、胃癌)的诊断和治疗结果相关。总的来说，实体瘤患者TK1蛋白水平也会有明显的升高，并且在实体瘤病例中测定TK1浓度甚至可能比测定TK1活性有更好的灵敏度。通常正常人的TK1水平平均值在1pM左右，具体值取决于个体差异，但是总的来说处于0-2pM之间。对于异常增殖类病变，由于病变细胞缺失了凋亡调控，DNA合成剧增会导致TK1水平的异常升高，即存在恶性增殖病变患者血清内TK1酶含量会比正常人有2-200倍的升高。因此TK1目前也被作为一种非特异性肿瘤标志物，应用于体检及临床中的恶性增殖病变筛查和治疗后的跟踪监测。目前，测定TK1的方法主要是酶联免疫法(ELISA)。该方法通常依靠手工操作，比较耗费人力和时间，同时其检测的灵敏度和线性范围也较低，主要用于实验室分析，在临床的检测应用上具有一定的局限性，远不能满足临床需求。目前市场上仍缺乏速度快、稳定性好、灵敏度高、特异性强的TK1测定试剂，尤其是自动化检测试剂。因此，研发生产质量达到临床要求、实用性强、性价比高，可应用于全自动化学发光分析仪的TK1测定试剂已成为国内外体外诊断试剂行业的热点。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种胸苷激酶1磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法，可以实现在全自动化学发光分析仪上对TK1的高通量、快速化检测，且具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，有效降低TK1检测成本，有利于临床推广使用。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：一种胸苷激酶1磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含试剂A、试剂B和胸苷激酶1(TK1)校准品，其中试剂A为包被有抗胸苷激酶1(TK1)抗体的磁微粒混悬液，试剂B为碱性磷酸酶标记的抗胸苷激酶1(TK1)抗体酶结合物试剂。进一步地，所述的试剂A是由0.05-0.2mol/L的缓冲液、0.1％-0.5％防腐剂、1％-10％表面活性剂、0.01％-0.08％包被有TK1抗体的磁微粒配制而成。进一步地，所述的磁微粒为Fe2O3或Fe3O4磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体，在所述磁微粒表面含有一种或多种活性功能基团。进一步地，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液、2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液或羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中的一种或多种；所述缓冲液的pH值为6～9；进一步地，所述防腐剂选自叠氮化钠、N-甲基-异噻唑酮、N'-亚甲基-双[N'-(3-羟甲基-2,5-二酮-4-咪唑烷基)]脲或ProClin300中的一种或多种；进一步地，所述表面活性剂选自吐温20、吐温80、环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物或聚乙二醇辛基苯基醚；进一步地，所述包被有TK1抗体的磁微粒为选择不同粒径和表面活性功能基团的磁微粒与TK1抗体形成的复合物，所述磁微粒表面的活性功能基团选自对甲苯磺酰基或羧基，所述的磁微粒的粒径为0.1-5μm。进一步地，所述的试剂B是由0.05-0.2mol/L的缓冲液、0.1％-0.5％防腐剂、1％-10％表面活性剂、1％-10％保护蛋白、0.1-1.0μg/ml碱性磷酸酶标记的TK1抗体酶结合物配制而成。进一步地，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液、2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液或羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中的一种或多种；所述缓冲液pH值为6～9；进一步地，所述防腐剂选自叠氮化钠、N-甲基-异噻唑酮、N'-亚甲基-双[N'-(3-羟甲基-2,5-二酮-4-咪唑烷基)]脲或ProClin300中的一种或多种；进一步地，所述表面活性剂选自吐温20、吐温80、十二烷基磺酸钠或聚乙二醇辛基苯基醚；进一步地，所述保护蛋白选自酪蛋白酸钠或牛血清白蛋白；进一步地，所述碱性磷酸酶标记的TK1抗体酶结合物为碱性磷酸酶和TK1抗体形成的复合物。进一步地，所述试剂A和试剂B中的TK1抗体为两种结合位点不同的单克隆抗体；两种TK1抗体选自兔抗多克隆抗体、羊抗多克隆抗体或鼠抗单克隆抗体。进一步地，所述试剂A和试剂B的体积比为1:5。本专利技术试剂盒所述TK1校准品包含校准品1、校准品2、校准品3、校准品4、校准品5和校准品6。其中校准品1是指将TK1用牛血清制品得到校准品；校准品2是指将TK1用牛血清制品稀释成浓度为1pmol/ml得到校准品；校准品3是指将TK1用牛血清制品稀释成浓度为2pmol/ml得到校准品；校准品4是指将TK1用牛血清制品稀释成浓度为5pmol/ml得到校准品；校准品5是指将TK1用牛血清制品稀释成浓度为10pmol/ml得到校准品；校准品6是指将TK1用牛血清制品稀释成浓度为50pmol/ml得到校准品。本专利技术的原理为：本专利技术使用试剂A中的包被有TK1抗体的磁微粒，与样品中的TK1进行反应并形成TK1-TK1抗体包被的磁微粒复合物，同时试剂B中碱性磷酸酶标记的TK1抗体酶结合物也会与TK1-TK1抗体包被的磁微粒反应，形成TK1抗体包被的磁微粒-TK1-碱性磷酸酶标记的TK1抗体复合物。孵育反应之后，利用全自动化学发光分析仪中的相应磁力设备，在保留TK1抗体包被的磁微粒-TK1-碱性磷酸酶标记的TK1抗体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胸苷激酶1磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含试剂A、试剂B和胸苷激酶1(TK1)校准品，其中试剂A为包被有抗胸苷激酶1(TK1)抗体的磁微粒混悬液，试剂B为碱性磷酸酶标记的抗胸苷激酶1(TK1)抗体酶结合物试剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种胸苷激酶1磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含试剂A、试剂B和胸苷激酶1(TK1)校准品，其中试剂A为包被有抗胸苷激酶1(TK1)抗体的磁微粒混悬液，试剂B为碱性磷酸酶标记的抗胸苷激酶1(TK1)抗体酶结合物试剂。


2.根据权利要求1所述的一种胸苷激酶1磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述的试剂A是由0.05-0.2mol/L的缓冲液、0.1％-0.5％防腐剂、1％-10％表面活性剂、0.01％-0.08％包被有TK1抗体的磁微粒配制而成。


3.根据权利要求1所述的一种胸苷激酶1磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述的磁微粒为Fe2O3或Fe3O4磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体，在所述磁微粒表面含有一种或多种活性功能基团。


4.根据权利要求2或3所述的一种胸苷激酶1磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液、2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液或羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中的一种或多种；所述缓冲液的pH值为6～9；
所述防腐剂选自叠氮化钠、N-甲基-异噻唑酮、N'-亚甲基-双[N'-(3-羟甲基-2,5-二酮-4-咪唑烷基)]脲或ProClin300中的一种或多种；
所述表面活性剂选自吐温20、吐温80、环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物或聚乙二醇辛基苯基醚；
所述包被有TK1抗体的磁微粒为选择不同粒径和表面活性功能基团的磁微粒与TK1抗体形成的复合物，所述磁微粒表面的活性功能基团选自对甲苯磺酰基或羧基，所述的磁微粒的粒径为0.1-5μm。


5.根据权利要求1所述的一种胸苷激酶1磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，所述的试剂B是由0.05-0.2mol/L的缓冲液、0.1％-0.5％防腐剂、1％-10％表面活性剂、1％-10％保护蛋白、0.1-1.0μg/ml碱性磷酸酶标记的TK1抗体酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗紫臣，
申请(专利权)人：上海复星长征医学科学有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31