一种用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体及其构建方法和应用，该载体由于含有FLuc片段、用于插入待抑制靶基因的第一多克隆位点、RLuc表达框以及用于插入待筛选shRNA的第二多克隆位点等基因片段，因此同时具备报告基因载体、shRNA真核表达载体和内参载体这三个功能。在进行双萤光素酶报告基因实验时，仅需要向细胞转染一个该载体，即可替代传统实验共同转染三个载体的操作，彻底解决了由于三个载体比例出现偏差所引起的萤光素酶活力比值的波动问题，能够增强双萤光素酶报告系统的信噪比，提高筛选抑制靶基因表达shRNA的准确性。

Double luciferase reporter gene vector for screening shRNA, construction method and application thereof

The invention discloses a luciferase reporter gene vector and its construction method and application for double fluorescent screening of shRNA, the carrier due to the presence of FLuc fragments for insertion to inhibit the target gene of the first multiple cloning site, the expression of RLuc and shRNA frame to be screened for insertion of article more than 2 of the cloning site such as gene fragments, so also have the expression reporter gene vector and shRNA eukaryotic vector and expression vector of these three functions. In the dlrtm experiment, only need to one of the cells transfected with vector, can replace the traditional experimental co transfected three carrier operation, completely solve the problem of three due to fluctuations in the proportion of the carrier deviation caused by the ratio of luciferase activity, can enhance the dual luciferase reporter system. The signal-to-noise ratio and improve the accuracy of screening to inhibit the expression of target gene shRNA.

【技术实现步骤摘要】
一种用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体及其构建方法和应用
本专利技术属于生物
，涉及一种用于准确筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体及其构建方法和应用。
技术介绍
RNA干扰(RNAi)是短发夹RNA(shRNA)或小干扰RNA(siRNA)介导的沉默或抑制目标基因表达的过程，该技术已广泛应用于基因功能、肿瘤发生发展及基因治疗等研究领域。为了使特定基因沉默表达，可针对该基因序列信息设计不同靶点的shRNA，但不同的shRNA所引起的沉默表达程度往往存在差异。因此，准确高效的筛选能够有效抑制靶基因表达的shRNA是应用RNAi技术进行研究和应用的基础。双萤光素酶报告基因实验(Dual-LuciferaseAssay)是检测shRNA对靶基因表达抑制程度的首选研究方法。该方法的基本原理是将靶基因构建到萤火虫萤光素酶(FireflyLuciferase,FLuc)基因的3'非翻译区，使靶基因跟随FLuc基因一同转录为嵌合mRNA。若shRNA对靶基因具有抑制作用，则会降低FLuc/靶基因嵌合mRNA的稳定性，导致FLuc表达量下降，引起FLuc活力减弱。shRNA对靶基因的抑制作用越强，FLuc活力降低的程度越明显。为了减小细胞活性和转染效率等外在因素对FLuc活力测定的影响，常在细胞中同时组成性表达海肾萤光素酶(RenillaLuciferase,RLuc)作为内参，为试验提供基准线。双萤光素酶报告基因检测系统在细胞中同时表达FLuc和RLuc，两者来源于不同物种并对应不同的反应底物，故而没有交叉干扰。目前，应用双萤光素酶报告系统筛选抑制靶基因表达shRNA的传统实验方法需要构建三个载体，一是将靶基因构建至FLuc基因3'非翻译区的报告基因载体，二是产生待筛选shRNA的真核表达载体，三是表达RLuc的内参载体。实验中需要将上述三个载体按照一定比例混合后，共同瞬时转染细胞，而后分别测定FLuc和RLuc活力，计算二者比值，比值越低表示shRNA对靶基因表达的抑制效果越强。然而在具体操作中，研究人员发现虽然在实验中使用RLuc作为内参对照，但是由于受到无法避免的加样误差和细胞转染效率差异等因素的干扰，使得实际进入各个细胞的三个载体的比例必然不会完全相同，导致即使相同shRNA实验组的不同重复样本的荧光素酶活力比值之间往往存在较大的波动，大大削弱了实验的准确性和可靠性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体及其构建方法和应用，该载体同时具备报告基因载体、shRNA真核表达载体和RLuc内参载体三个功能，能够解决传统实验方法应用双萤光素酶报告系统筛选抑制靶基因表达shRNA时测定结果波动较大、重复性差的问题。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体，所述用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体包括CMV启动子、FLuc片段、用于插入待抑制靶基因的第一多克隆位点、SV40PolyA结构、RLuc表达框、HSV-TK启动子、大肠杆菌启动子、SV40启动子、SV40复制起点、Kan/Neo抗性基因、用于插入待筛选shRNA的第二多克隆位点和HSV-TKPolyA结构。所述用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体还包括用以增强RLuc表达的嵌合人β-球蛋白内含子、f1单链DNA复制起点、pUC质粒复制起点、用于对插入第一多克隆位点的待抑制靶基因进行测序的测序引物FLuc-C-f和用于对插入第二多克隆位点的待筛选shRNA进行测序的测序引物shRNA-f。其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。所述的用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体的构建方法，包括以下步骤：1)先以pGL3-Basic载体为模板，采用PCR方法扩增制备出FLuc片段，然后采用定向克隆法将制备的FLuc片段替换pEGFP-C1质粒中的EGFP片段，构建成为pFLuc-C质粒；2)以pRL/TK载体为模板，采用PCR方法扩增制备出RLuc表达框，再以同源重组的方法将RLuc表达框插入pFLuc-C质粒中，构建成为pFLuc-C-TK-RLuc载体；3)以pFLuc-C-TK-RLuc载体为模板，采用PCR方法在该载体的Kan/Neo抗性基因终止码后引入用于插入待筛选的shRNA的多克隆位点，构建成为pFLuc-C-TK-RLuc-shRNA载体，即为用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体。所述步骤1)中PCR过程中使用的引物为P1和P2，获得的FLuc片段中含有NheI和XhoI酶切位点，其中引物P1和P2具体如下：P1：5'-ggggctagcgtcgaccgccaccatggaagacgccaaaaacataaag-3'；P2：5'-tttctcgagccttctgttgggttaagaagtcgattacacggcgatctttccgcccttc-3'。所述步骤2)中PCR过程中使用的引物为P3和P4，获得的RLuc表达框含有与pFLuc-C质粒进行重组反应的短臂，其中引物P3和P4具体如下：P3：5'-caatttacgccttaaagatctaaatgagtcttcggacctc-3'；P4：5'-atcaatgtatcttaatcatgtctgctcgaagcggccgctc-3'。所述步骤3)中PCR过程中使用的引物为P5和P6，步骤3)中经PCR获得的扩增产物的5'端含有PacI和EcoRI酶切位点，3'端含有XhoI和PacI酶切位点，该扩增产物经PacI酶切后，连接成环，构建成为pFLuc-C-TK-RLuc-shRNA载体，其中引物P5和P6具体如下：P5：5'-aaattaattaaactagtgcgggactctggggttcgaaatgaccgac-3'；P6：5'-aaattaattaagatatctcagaagaactcgtcaagaaggcgatagaag-3'。所述的用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体在双萤光素酶报告基因检测方面的应用。所述用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体用于代替双萤光素酶报告基因检测系统中的三个载体，所述三个载体分别为将靶基因构建至FLuc基因3'非翻译区的报告基因载体、产生待筛选shRNA的真核表达载体以及表达RLuc的内参载体。相对于现有技术，本专利技术的有益效果为：本专利技术构建了一个可单独使用的重组质粒载体，即用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体(pFLuc-C-TK-RLuc-shRNA载体)，由于该载体含有FLuc片段、用于插入待抑制靶基因的第一多克隆位点、RLuc表达框以及用于插入待筛选shRNA的第二多克隆位点等基因片段，所以该载体能够同时具备将靶基因构建至FLuc基因3'非翻译区的报告基因载体、产生待筛选shRNA的真核表达载体和表达RLuc的内参载体这三个功能。在进行双萤光素酶报告基因实验时，仅需要向细胞转染一个本专利技术提供的用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体，即可替代传统实验共同转染三个载体的操作，彻底解决了由于三个载体比例出现偏差所引起的萤光素酶活力比值的波动问题，能够增强双萤光素酶报告系统的信噪比，提高筛选抑制靶基因表达shRN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体，其特征在于：所述用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体包括CMV启动子、FLuc片段、用于插入待抑制靶基因的第一多克隆位点、SV40PolyA结构、RLuc表达框、HSV‑TK启动子、大肠杆菌启动子、SV40启动子、SV40复制起点、Kan/Neo抗性基因、用于插入待筛选shRNA的第二多克隆位点和HSV‑TK PolyA结构。

【技术特征摘要】
1.一种用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体，其特征在于：所述用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体包括CMV启动子、FLuc片段、用于插入待抑制靶基因的第一多克隆位点、SV40PolyA结构、RLuc表达框、HSV-TK启动子、大肠杆菌启动子、SV40启动子、SV40复制起点、Kan/Neo抗性基因、用于插入待筛选shRNA的第二多克隆位点和HSV-TKPolyA结构。2.根据权利要求1所述的用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体，其特征在于：所述用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体还包括用以增强RLuc表达的嵌合人β-球蛋白内含子、f1单链DNA复制起点、pUC质粒复制起点、用于对插入第一多克隆位点的待抑制靶基因进行测序的测序引物FLuc-C-f和用于对插入第二多克隆位点的待筛选shRNA进行测序的测序引物shRNA-f。3.根据权利要求1或2所述的用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。4.权利要求1-3中任意一项所述的用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)先以pGL3-Basic载体为模板，采用PCR方法扩增制备出FLuc片段，然后采用定向克隆法将制备的FLuc片段替换pEGFP-C1质粒中的EGFP片段，构建成为pFLuc-C质粒；2)以pRL/TK载体为模板，采用PCR方法扩增制备出RLuc表达框，再以同源重组的方法将RLuc表达框插入pFLuc-C质粒中，构建成为pFLuc-C-TK-RLuc载体；3)以pFLuc-C-TK-RLuc载体为模板，采用PCR方法在该载体的Kan/Neo抗性基因终止码后引入用于插入待筛选的shRNA的多克隆位点，构建成为pFLuc-C-TK-RLuc-shRNA载体，即为用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体。5.根据权利要求4所述的用于筛选shRNA的双萤光素酶报告基因载体的构建方法，其特征在于：所述步骤1)中PCR过程中使用的引物为P1和P2...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨安钢，阎博，刘欣禹，赵晶，杜晓，欧阳清，胡志嵩，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61