一种斑茅植物根尖分生区染色体标本的制备方法技术

本发明专利技术提出一种斑茅植物根尖分生区染色体标本的制备方法，该方法包括以下步骤：根尖培养、根尖取样及前处理、根尖酶解、染色体制片和镜检等步骤，其特点是桶栽整株培养根系；根尖处理采用0.002M 8‑羟基喹啉水溶液25~28℃处理3~4小时，采用酶解去壁低渗法制片。本发明专利技术可操作性强，容易获得高活性分生区的根尖，节约根尖培养的时间，节省人力物力，制片效率高，得到分生区细胞的中期分裂相多，获得的染色体形态清晰、分散均匀，特别适合斑茅属植物的染色体制片，本方法同样适用于甘蔗及其近缘属植物的染色体制片。

Method for preparing chromosome specimen of meristematic zone of root tip plant of spotted grass

The invention provides a preparation method of e.arundinaceus plant apical meristem chromosome, the method comprises the following steps: root culture, root sampling and pretreatment, enzymatic hydrolysis, root tip chromosome and microscopic steps, which is characterized by pot cultivation of whole plant root; root treatment with 0.002M 8 hydroxy quinoline 25~28 aqueous solution treatment for 3~4 hours, using enzyme WDH method. The invention has strong operability, easy to obtain high activity of root tip meristematic zone, saving root culture time, save manpower, production efficiency is high, by mid meristematic cell division phase, chromosome morphology obtained clear and uniform dispersion, especially suitable for the genus Erianthus chromosomes in plants, the the method is also applicable to sugarcane and its related genera of chromosome.

【技术实现步骤摘要】
一种斑茅植物根尖分生区染色体标本的制备方法
本专利技术涉及植物细胞遗传学中的植物染色体中期相标本的制备方法，尤其涉及斑茅植物根尖染色体的制备方法。技术背景染色体是遗传物质的载体，在不同的物种中染色体具有较为稳定的数目和形态。细胞染色体遗传研究在遗传育种具有重要的地位，染色体标本的制备是细胞遗传学研究的基本实验方法。植物染色体标本制备包括以下几个流程：根尖培养、取材、前处理、固定、酶解（或解离），制片及镜检。斑茅Erianthusarundinaceus(Retz.)Jeswiet.为多年生草本，直立丛生，无地下茎，分布极广，适应性极强。它具有抗旱、耐涝、耐瘠、抗病虫能力强、分蘖多、宿根性好、生长力旺盛等特点，具有甘蔗育种者所追求的能被甘蔗育种所利用的优异性状，所以倍受世界各国育种家青睐。目前国内外已经突破了甘蔗与斑茅的属间杂交获得了多代材料。斑茅及其与甘蔗杂交的后代对甘蔗遗传改良具有重要的意义。多数的斑茅的染色体数目2n=60条，研究人员也曾发现有2n=40条，但比水稻、玉米、高粱等作物染色体条数多，染色体制片难度大。特别是斑茅根尖的培养一直是个难点，传统的植物根尖培养的方法如水稻、玉米、小麦是通过种子发芽等根尖来获得。斑茅为无性系植物一般参照甘蔗的方法，通过获取斑茅植物的茎段，对茎段的节上根点保湿培养来获得新生的根，长至1cm左右取根尖。但是斑茅茎多为空绵心，节上的根点较少，保湿后能长出根的根点更少，传统方法培养根需要大量的斑茅茎段，此外在培养茎段过程中的温度和湿度控制的要求较高，根尖长出后容易褐化停止生长，以致要获得活性较强的根尖不容易。以传统的斑茅制片方法获得较好的染色体制片难度大，研究人员都在寻求一种高效的斑茅染色体制备方法，能在较短时间内获得活性好的斑茅根尖，具有较多的分裂相细胞，不需要反复砍茎培养、取根，节省人力物力，提高斑茅染色体制备效率。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种斑茅植物根尖分生区染色体标本的制备方法，其具有节省时间和实验材料及劳力，提高实验效率的效果。本专利技术的技术方案如下：一种斑茅植物根尖分生区染色体标本的制备方法，包括以下步骤。（1）根尖培养：初春，剪取斑茅幼嫩植株种植于培养桶内，培养桶的侧边及底部打孔透水，桶内底部为保水透气基质，通过正常的水、肥及除草等栽培管理，3~4个月后斑茅的根会盘绕于桶内的四周及底部。（2）根尖取样及前处理：于夏季晴朗天气早晨8:00~10:00，将整植株连同基质与培养桶分离，挑选活性高的根尖，用手术刀切取约0.5cm的根尖，放置于蒸馏水中漂洗，漂洗后投入浓度为0.002M的8-羟基喹啉水溶液25~28℃处理3~4小时，处理后用蒸馏水漂洗，纱布擦去根系表分泌物后，再放置于卡诺氏固定液中、4℃冰箱处理24~48小时。（3）根尖酶解从步骤（2）的冰箱中取出根尖，用蒸馏水漂洗2~3次，洗净固定液后，放置于0.075MKCl溶液前低渗1小时，后取出根尖放置于含有纤维素和果胶酶的酶解混合溶液中酶解5~8小时，酶解后用蒸馏水洗去酶解液，后低渗1小时，转入卡诺氏固定液固定0.5小时。（4）染色体制片用手术刀和镊子将步骤（3）的根尖分生区细胞解离出，并均匀涂抹于玻片上，晾干。（5）镜检将步骤（4）中晾干的玻片置于具有相差功能的光学显微镜下进行镜检，选择染色体形态好、分散好的细胞，做好记录，-80℃保存备用。优化方案是：步骤（3）所述的酶解混合液的浓度，纤维素和果胶酶的质量浓度分别为3.5%和1.75%。本专利技术与现有技术相比具有以下突出的实质性特点和显著的进步。1.本专利技术采用的是桶栽整株取根的方法进行根尖培养，根尖活性强，效果稳定，具有节省时间、实验材料及劳力、提高实验效率等优点。2.本专利技术获得的细胞制片干净，细胞中期分裂相多，染色体分散、形态好，可用于染色体进行核型分析或下游实验（如染色体荧光原位杂交）等染色体遗传研究，为斑茅种质染色体遗传研究提供有效的技术储备。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的说明。实施例一种斑茅植物根尖分生区染色体的制备方法，包括如下步骤。（1）根尖培养：初春，将剪取斑茅幼嫩植株2-3株种植于规格上口直径35cm下口直径27cm高度32cm牛津桶，桶四面及底部打直径为2cm孔透水透气，桶内底部放入3cm左右厚度的松树皮，以菜田土为种植基质，厚度约为15cm，通过正常的水、肥及除草等栽培管理，使植株在良好的条件下茁壮成长，3个月后植株进入生长旺盛期，斑茅根系会缠绕桶内底部及边缘。（2）根尖取样及前处理：夏季早上9：00~10：00将整植株连同基质与桶分离，此时根系生长旺盛，粗壮的根系爬满基质与桶之间，选取底部或边缘白颜色较为透亮，生长旺盛，健康的根尖，用手术刀切取约0.5cm的根尖，放置于蒸馏水中漂洗，漂洗后投入浓度为0.002M的8-羟基喹啉水溶液25~28℃处理4小时，蒸馏水漂洗后，用纱布擦去根表分泌物后投入卡诺氏固定液于4℃冰箱处理24~48小时。（3）根尖酶解：从冰箱取出根尖，用蒸馏水漂洗2~3次后，放置于0.075MKCl溶液前低渗60min，后取出根尖放置于含纤维素3.5%和果胶酶1.75%的酶解混合液中酶解5~8h（视其根尖的大小确定酶解时间），后用蒸馏水洗去酶液，后低渗60min，转入卡诺氏固定液后固定30min。（4）染色体制片：用镊子和手术刀，将步骤（3）的根尖分生区细胞解离出，均匀涂抹于载玻片，晾干。（5）镜检：将晾干的玻片放置于具有相差功能的显微镜镜检，选择染色体形态好、分散好的细胞，做好记录，-80℃保存备用。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种斑茅植物根尖分生区染色体标本的制备方法，其特征在于包括如下步骤：（1） 根尖培养：初春，剪取斑茅幼嫩植株种植于培养桶内，培养桶的侧边及底部打孔透水，桶内底部为保水透气基质，通过正常的水、肥及除草等栽培管理，3~4个月后斑茅的根会盘绕于桶内的四周及底部；（2） 根尖取样及前处理：将整植株连同基质与培养桶分离，挑选活性高的根尖，用手术刀或手术剪取长度约为0.5cm的根尖，放置于蒸馏水中漂洗，漂洗后投入浓度为0.002M的8‑羟基喹啉水溶液、25~28℃处理3~4小时，处理后用蒸馏水洗净，再放置于卡诺氏固定液中、4℃冰箱处理24~48小时；（3）根尖酶解：从步骤（2）的冰箱中取出根尖，用蒸馏水漂洗2~3次，洗净固定液后，放置于0.075M KCl溶液低渗1小时，后取出根尖并放置于含有纤维素和果胶酶的酶解混合液中酶解5~8小时，酶解后用蒸馏水洗净后低渗1小时，转入卡诺氏固定液固定0.5小时；（4）染色体制片：用镊子和手术刀将步骤（3）的根尖分生区细胞解离出，并均匀涂抹于载玻片上，晾干。（5）镜检：将步骤（4）晾干的玻片放置于具有相差功能的显微镜镜检，选择染色体形态好、分散好的细胞，做好记录，‑80℃保存备用。...

【技术特征摘要】
1.一种斑茅植物根尖分生区染色体标本的制备方法，其特征在于包括如下步骤：（1）根尖培养：初春，剪取斑茅幼嫩植株种植于培养桶内，培养桶的侧边及底部打孔透水，桶内底部为保水透气基质，通过正常的水、肥及除草等栽培管理，3~4个月后斑茅的根会盘绕于桶内的四周及底部；（2）根尖取样及前处理：将整植株连同基质与培养桶分离，挑选活性高的根尖，用手术刀或手术剪取长度约为0.5cm的根尖，放置于蒸馏水中漂洗，漂洗后投入浓度为0.002M的8-羟基喹啉水溶液、25~28℃处理3~4小时，处理后用蒸馏水洗净，再放置于卡诺氏固定液中、4℃冰箱处理24~48小时；（3）根尖酶解：从步骤（2）的冰箱中取出根尖，用蒸馏水漂洗2~3次，洗净固定液后，放置于0.075MKCl溶液低渗1小时，后取出根尖并放置于含有纤维素...

【专利技术属性】
技术研发人员：王勤南，吴嘉云，常海龙，凌秋平，张伟，邱永生，陈俊吕，谢静，
申请(专利权)人：广东省生物工程研究所广州甘蔗糖业研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44