一种防治虹鳟鱼传染性造血器官坏死症的活载体疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种防治虹鳟鱼传染性造血器官坏死症的活载体疫苗的制备方法，将传染性造血器官坏死症病毒抗原蛋白G基因插入到复制缺陷型腺病毒穿梭载体的特异性启动子和终止子之间，构建得到含有G基因的重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体，再将重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体与腺病毒骨架载体通过同源重组得到重组腺病毒质粒，用重组腺病毒质粒产生基因组结构均一的重组腺病毒，即得到防治虹鳟鱼传染性造血器官坏死症的活载体疫苗。本发明专利技术的有益效果为：相较于现有技术，本发明专利技术制备得到的活载体疫苗更为安全和有效，且制作周期较短，在虹鳟鱼传染性造血器官坏死症的预防或治疗领域将具有良好的应用前景。

Live vector vaccine for preventing and treating infectious hematopoietic necrosis of rainbow trout, preparation method and application thereof

The invention discloses a method for preparing a vaccine preventing trout infectious hematopoietic necrosis of the infectious hematopoietic necrosis virus antigen protein G gene inserted into specific promoter of replication defective adenovirus shuttle vector and terminator to construct containing G gene recombinant replication defective adenovirus shuttle vector, then the recombinant replication defective adenovirus shuttle plasmid and adenovirus backbone vector to obtain the recombinant adenovirus plasmid by homologous recombination, recombinant adenovirus recombinant adenovirus plasmid to produce uniform genome structure, obtain the live vector vaccine prevention of rainbow trout infectious hematopoietic necrosis. The invention has the advantages that compared with the prior art, the live vector vaccine prepared by the invention is more safe and effective, and the production cycle is short, will have a good application prospect in the field of rainbow trout for prevention or treatment of infectious hematopoietic necrosis.

【技术实现步骤摘要】
一种防治虹鳟鱼传染性造血器官坏死症的活载体疫苗及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物疫苗制备
，具体涉及一种防治虹鳟鱼传染性造血器官坏死症的活载体疫苗及其制备方法和应用。
技术介绍
传染性造血器官坏死症（InfectiousHematopoieticNec-rosis，IHN）是由传染性造血器官坏死病毒（InfectiousHematopoieticNec-rosisVirus，IHNV）感染引起的鲑鳟鱼类的一种严重的急性、传染性病毒病，该病毒属于弹状病毒科诺拉弹状病毒属，基因组为不分节段的单股负链RNA病毒。根据鱼的种类、年龄、病毒株系以及环境条件的不同，IHN的爆发可能导致鱼体80%～100%的死亡率，对世界鲑鱼养殖业造成了重大损失。目前已成为制约鲑鱼养殖发展的重要威胁，由于其发病急、发病率高，已被国际兽医局OIE列为必须申报的疾病，被我国列为二类疫病。对健康的鱼体进行早期免疫接种是预防病毒病的常用方法。疫苗接种可以刺激鱼类免疫系统产生特异性免疫反应，增强鱼体抗病力，从而降低疾病的发生率。目前为了控制IHNV已经研制出2种类型的疫苗，即灭活疫苗、减毒疫苗。但由于病毒在体外扩繁效率较低，灭活疫苗生产成本昂贵，以及灭活不彻底而造成散毒的潜在危险等因素的存在，限制了其的广泛使用。因此，研制安全、高效的新型传染性造血器官坏死症分子疫苗显得非常必要。活载体疫苗是近年来研究的热点之一，被认为是一种很有开发前景的疫苗。制苗时往活载体中插入外源保护性目的基因，由于外源基因已经成为作为载体的病毒或细菌的自身结构的一部分，故所产生的免疫应答水平通常不低于完整病毒或细菌相应成分所引起的免疫强度。重组腺病毒载体具有宿主范围广，对外界有一定的抵抗力，被认为是基因工程疫苗的优良载体。复制缺陷型腺病毒常缺失对于病毒复制所必需的病毒早期基因E1区，使其在体内不能复制，因此研制重组复制缺陷型腺病毒传染性造血器官坏死症疫苗更为安全和有效。传染性造血器官坏死症病毒有6种结构蛋白，其中糖蛋白G与病毒的感染和免疫有密切关系。Andersonetal首次报道了IHNVDNA疫苗的应用，通过使用含有IHNVG蛋白基因的质粒免疫虹鳟鱼可以诱导虹鳟鱼产生针对IHNV的保护性免疫。2005年7月，IHNV的DNA疫苗CMV启动子操纵IHNVG蛋白基因的表达，已在加拿大被批准商品化。活载体疫苗具有安全、高效、生产费用低廉等优点，但目前尚未有传染性造血器官坏死症活载体疫苗上市。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种利用腺病毒载体表达传染性造血器官坏死症传染性造血器官坏死症病毒G蛋白制备传染性造血器官坏死症活载体疫苗的方法，获得了安全、高效的传染性造血器官坏死症传染性造血器官坏死症疫苗。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为：一种防治虹鳟鱼传染性造血器官坏死症的活载体疫苗的制备方法，将传染性造血器官坏死症病毒抗原蛋白G基因插入到复制缺陷型腺病毒穿梭载体的特异性启动子和终止子之间，构建得到含有G基因的重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体，再将重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体与腺病毒骨架载体通过同源重组得到重组腺病毒质粒，用重组腺病毒质粒产生基因组结构均一的重组腺病毒，即得到防治虹鳟鱼传染性造血器官坏死症的活载体疫苗。进一步的，上述的一种防治虹鳟鱼传染性造血器官坏死症的活载体疫苗的制备方法，所述传染性造血器官坏死症病毒抗原蛋白G基因是通过PCR方法扩增出的，扩增引物序列分别为SEQIDNo.1（GF）和SEQIDNo.2（GR）。SEQIDNo.1（GF）：5’GCAGATCTGCCACCgccaccatgtacaccatg3’（含有BglⅡ酶切位点）；SEQIDNo.2（GR）：5’GCGTCGttaggaccggtttgccagg3’（含有SalⅠ酶切位点）。进一步的，上述的一种防治虹鳟鱼传染性造血器官坏死症的活载体疫苗的制备方法，所述重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体的构建过程中，腺病毒载体启动子为CMV，终止子为PolyA；构建过程具体包括以下步骤：1）将扩增得到的目的基因G经BglⅡ、SalⅠ双酶切，形成带有粘性末端的目的基因片段；2）同时，将腺病毒穿梭载体PAdTrack-CMV经BglⅡ、SalⅠ双酶切，得到线性化的载体；3）使用T4DNA连接酶对步骤1）和2）的产物进行粘端连接；4）按常规方法将连接产物转化大肠埃希氏菌，在含卡那抗性的琼脂平板上筛选，挑选克隆后，提取质粒；5）采用酶切、PCR扩增方法鉴定，得到阳性重组质粒，命名为PAdTrack-CMV/G；鉴定方法是指采用PCR和限制性内切酶鉴定，进行琼脂糖凝胶电泳分析检测的方法，来确定抗原蛋白G基因是否已经整合到腺病毒载体中。进一步的，上述的一种防治虹鳟鱼传染性造血器官坏死症的活载体疫苗的制备方法，重组腺病毒质粒的获得包括以下步骤：1）将重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体PAdTrack-CMV/G用PmeI单酶切以线性化；2）取PAdEasy-1与步骤1）得到的线性化后的重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体混合，高压电转化大肠杆菌BJ5183；3）电转后将细胞在培养液中复苏，取细胞涂入含卡那霉素的培养板中，培养；4）挑选卡那霉素抗性克隆，小量提取质粒DNA，用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳迁移率分析，并进行限制性内切酶图谱分析；5）将所得的重组腺病毒质粒高压电转化入宿主菌，从此宿主菌中获得的大量高质量质粒中挑选目的克隆，所述宿主菌为DH10B。进一步的，上述的一种防治虹鳟鱼传染性造血器官坏死症的活载体疫苗的制备方法，重组腺病毒质粒产生基因组结构均一的重组腺病毒，包括以下步骤：1）将重组腺病毒质粒，用PacI酶切，完全消化以切去包括Ori和Kan抗性基因在内的质粒构件，并暴露其反转末端重复序列；2）脂质体介导的转染，在组织培养皿中接种293细胞进行转染；3）取病毒上清接种293细胞，以含2%小牛血清的完全DMEM培养液于培养箱中培养，逐日观察细胞病变，至293细胞完全病变；4）收集病毒感染的病变细胞，检测抗原蛋白G基因的表达，再连同上清液冻存；检测抗原蛋白G基因表达的方法为：利用倒置显微镜观测细胞病变和荧光显微镜观测报告基因绿色荧光蛋白的表达来确定抗原蛋白G-基因是否获得表达。进一步的，上述的一种防治虹鳟鱼传染性造血器官坏死症的活载体疫苗的制备方法，所述步骤2）中脂质体介导的转染，包括以下步骤：a）稀释PacI酶切线性化的重组腺病毒质粒至DMEM培养液中；b）再将脂质体悬液加至DMEM培养液中，充分将二者混匀，室温下温育；c）在此期间吸弃细胞原培养液，用DMEM培养液洗细胞一次；d）往每平皿中加DNA/脂质体复合物，在5%CO2培养箱中温育后吸弃含DNA/脂质体复合物的培养液；e）补加含10%小牛血清的DMEM完全培养液，继续培养，脂质体转染后收集细胞，反复冻融。本专利技术的第二个目的是提供了上述一种防治虹鳟鱼传染性造血器官坏死症的活载体疫苗的制备方法制备得到的含有抗原蛋白G基因的传染性造血器官坏死症病毒活载体疫苗。本专利技术的第三个目的是提供了上述含有抗原蛋白G基因的传染性造血器官坏死症病毒活载体疫苗在制备预防或治疗虹鳟鱼传染性造血器官坏死症的药物中的用途。本专利技术的有益效果为：本专利技术将传本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种防治虹鳟鱼传染性造血器官坏死症的活载体疫苗的制备方法，其特征在于，将传染性造血器官坏死症病毒抗原蛋白G基因插入到复制缺陷型腺病毒穿梭载体的特异性启动子和终止子之间，构建得到含有G基因的重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体，再将重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体与腺病毒骨架载体通过同源重组得到重组腺病毒质粒，用重组腺病毒质粒产生基因组结构均一的重组腺病毒，即得到防治虹鳟鱼传染性造血器官坏死症的活载体疫苗。

【技术特征摘要】
1.一种防治虹鳟鱼传染性造血器官坏死症的活载体疫苗的制备方法，其特征在于，将传染性造血器官坏死症病毒抗原蛋白G基因插入到复制缺陷型腺病毒穿梭载体的特异性启动子和终止子之间，构建得到含有G基因的重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体，再将重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体与腺病毒骨架载体通过同源重组得到重组腺病毒质粒，用重组腺病毒质粒产生基因组结构均一的重组腺病毒，即得到防治虹鳟鱼传染性造血器官坏死症的活载体疫苗。2.根据权利要求1所述的一种防治虹鳟鱼传染性造血器官坏死症的活载体疫苗的制备方法，其特征在于，所述传染性造血器官坏死症病毒抗原蛋白G基因是通过PCR方法扩增出的，扩增引物序列分别为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2。3.根据权利要求1所述的一种防治虹鳟鱼传染性造血器官坏死症的活载体疫苗的制备方法，其特征在于，所述重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体的构建过程中，腺病毒载体启动子为CMV，终止子为PolyA；构建过程具体包括以下步骤：1）将扩增得到的目的基因G经BglⅡ、SalⅠ双酶切，形成带有粘性末端的目的基因片段；2）同时，将腺病毒穿梭载体PAdTrack-CMV经BglⅡ、SalⅠ双酶切，得到线性化的载体；3）使用T4DNA连接酶对步骤1）和2）的产物进行粘端连接；4）按常规方法将连接产物转化大肠埃希氏菌，在含卡那抗性的琼脂平板上筛选，挑选克隆后，提取质粒；5）采用酶切、PCR扩增方法鉴定，得到阳性重组质粒，命名为PAdTrack-CMV/G。4.根据权利要求1所述的一种防治虹鳟鱼传染性造血器官坏死症的活载体疫苗的制备方法，其特征在于，重组腺病毒质粒的获得包括以下步骤：1）将重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体PAdTrack-CMV/G用PmeI单酶切以线性化；2）取PAdEasy-1与步骤1）得到的线性化后的重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体混合，高压电转化大肠杆菌BJ5183；3）电转后将细胞在培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳纪省，李宝玉，高鹏，李守湖，高欣，吴鹏程，范玉峰，
申请(专利权)人：兰州威特森生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：甘肃,62