一种筛选用于促进骨愈合的药物的方法技术

本发明专利技术公开了一种筛选用于促进骨愈合的药物的方法，所述方法包括以下步骤：(1)提供纤维致密型的血凝块；(2)将待测物质与步骤(1)的血凝块混合，调节血凝块的结构；(3)如果步骤(2)中的血凝块的结构由纤维致密型变为纤维稀疏型，那么步骤(2)中的待测物质为促进骨愈合的药物。本申请发明专利技术人首次揭示了血凝块的质地在正常骨愈合模型和骨延迟愈合模型中的显著差异，通过亚硝基谷胱甘肽干预血凝块的纤维结构，使其变为纤维疏松型血凝块后能明显地加快骨缺损愈合进程，影响局部细胞的移入、粘附、增殖、分化和生长因子的粘附、释放等一系列生理性活动，从而改善局部微环境，促进骨早期愈合。

【技术实现步骤摘要】
一种筛选用于促进骨愈合的药物的方法
本专利技术属于医学领域，尤其属于骨科领域。
技术介绍
(1)骨延迟愈合和不愈合是临床骨科极具挑战性的科学问题长久以来，由于严重创伤、疾病、感染等因素而导致骨块丢失过多的一系列并发症严重影响着患者的生活质量，尤其是骨延迟愈合(Delayedbonehealing)和骨不连(Bonynon-union)。目前，如何使骨组织又好又快地愈合，提高患者生活质量，已经成为临床骨科、口腔种植体医师的研究热点。在正常骨缺损愈合(Normalbonehealing)过程中，主要包括三个阶段：血肿(Hematoma)炎症机化期(Reactivephase)，骨痂形成期(Reparativephase)，和骨板形成塑形期(Remodelingphase)(图1)。骨组织的正常愈合涉及许多因素，包括足量的间充质干细胞(MesenchymalStemCells，MSCs)、生长因子、充足的血供、受损部位的机械力学稳定性等。在临床实践过程中，许多促进骨快速愈合的治疗方案已经被尝试，如骨替代物植入术、干细胞移植术等。然而，这些方法在运用的同时，也不可避免地带来一系列的问题，如新骨形成的诱导率不高、术中术后感染、材料本身的快速降解和机械强度不足、材料表面缺乏生物相容性。为了减少上述副作用，Platelet-richplasma(PRP)技术曾一度被尝试性运用于临床上帮助骨早期愈合。PRP技术是将患者自体血液(10mL)加入到10％柠檬酸钠溶液中，在室温下放入离心机中离心(160G，20分钟)，血液将分为血清层和血细胞层，移取两者分界线下6mm以上的溶液至新的无抗凝剂试管中，再次离心(400G，15分钟)，得到上层的血清层和下层的PRP层。临床使用前，需用凝血酶(Thrombin，T)和氯化钙溶液将其激活后局部使用。理论上讲，在骨折部位局部运用患者自体的PRP，在凝血酶和氯化钙刺激后，快速形成一个富集生长因子的纤维血凝块，一方面填充骨缺损部位达到快速止血的作用，另一方面它能释放内部的大量生长因子，从而促进骨折的早期愈合。尽管如此，一些学者通过构建大鼠和羊等骨缺损模型后植入PRP，并未发现PRP有任何明显促进骨愈合的作用。近年来，新兴的Platelet-richfibrin(PRF)技术得到临床骨科医师广泛的认可。PRF技术是在PRP技术基础的一种改良。在制作过程中，患者的血液被快速和直接地加入试管中，随后立即离心机(3000rpm，10分钟，20℃)，血液将会分为三层：最上层Plateletpoorplasma(PPP)，中间层PRF层，最下层红细胞层。由于在整个制作过程中未涉及到任何抗凝剂和凝血酶等生物制剂的参与，相比PRP而言，PRF自然而缓慢地形成的纤维结构被表明能更好地吸附激活血小板释放的生长因子，从而缓慢释放它们，提高成骨率。通过对比与成骨活动密切相关的生长因子Transforminggrowthfactor-β(TGF-β)和Platelet-derivedgrowthfactor(PDGF)发现，尽管PRP中含量明显高于PRF，但两者植入骨缺损部位后，PRF的成骨效果却较PRP更为显著。所以，有研究者认为PRF中的纤维结构可能为等边连接(Equilateraljunction)，为生长因子的缓慢释放或细胞的迁移、粘附和增殖创造更有利的环境，而PRP中的纤维结构可能为等腰连接(Bilateraljunction)，导致过快地释放生长因子或阻止细胞的迁移，因而并未达到显著成骨作用。血纤维结构的不同，提供给细胞活动的环境不同，对生长因子的粘附能力也有着不同，最终竟能导致截然不同的成骨效应。在导致骨延迟愈合或不愈合的众多因素中，骨缺损面积大小(Gapsize)一直被公认为是最为重要的因素之一。由于创伤过大，骨块丢失面积达到或超过临界点(Criticalsizedefect，CSD)时，必将引发骨不连的出现。因此，值得我们考虑的是，那么创伤较小的正常骨愈合和创伤较大的骨延迟愈合，两种不同骨缺损中所形成的血凝块的结构性质似乎也存在一些差异呢？简言之，骨折血凝块可能也有“好”或“坏”之分。迄今为止，血凝块变“好”或“坏”的最根本原因仍不清楚。血凝块的性质似乎与发生部位有一定的联系。显而易见地是，头皮血肿和皮下血肿通常不会分化成为骨组织，而骨折血凝块则可以机化、矿化为新鲜的骨组织。一般情况下，骨折部位形成的血凝块能演变为正常骨组织而没有任何并发症，但某些时候由于缺损过大、感染、血供不足等情况，骨折延迟愈合或骨不连仍会发生。所以，对于正常骨愈合和骨延迟愈合中血凝块结构的基础性研究，仍然是一个巨大的疑问。早在1990年，Mizuno就将一个4天的血凝块从大鼠股骨骨折部位，移植入肌肉内，最终发现肌肉内新骨形成。而把一个2天的血凝块采用相同的手术方式进行对照，则并未观察到新骨形成。这个实验表明了血凝块内部结构的成熟程度能显著影响骨愈合的能力。一个“好”血凝块应该具备以下的特征：①.除了有效止血以外，它能作为一个临时的纤维基质材料，进而促进MSC、成骨细胞的迁移、粘附、增殖和分化，因为细胞的迁移和粘附活动很大程度上依赖于基质的参与。②.一个“好”血凝块还应具有一定的多孔性，才能更好地促进氧气和其他营养物质的交换，同时也有利于代谢产物的排出。③.一个“好”血凝块，由于高渗透性和低密度纤维束，使它更容易被降解，从而为新生肉芽组织的长入提供更多的空间。④.一个“好”血凝块还应拥有一个较大的表面积，用以吸附游离的生长因子，并缓慢释放它们，从而更有效地提高成骨细胞分化率。(2)血凝块的形成过程和结构特征经典的凝血反应包括内源性和外源性两条通路。内源性凝血起始于前激肽释放酶、高分子量肽原(HighMolecularWeightKininogen，HMWK)和凝血因子XII等物质接触到异物表面。凝血因子XII一旦被激活，首先激活HMWK，HMWK正反馈进一步激活更多的XII因子，从而放大凝血效应。XIIa继续激活下游的XI因子，而XIa进一步在钙离子的协助下激活IX因子，激活的IXa和VIIIa因子，在钙离子和磷脂(Phospholipid，PL)存在的条件下，激活X因子转变为Xa，最后进入共同通路。对于骨折血凝块(实质上是纤维血凝块)而言，是通过外源性凝血通路来达到止血效果的(图2)。外源性凝血通路始于组织因子(TissueFactor,TF)的释放，它能进一步激活凝血因子VII，从而形成TF-VIIa复合物。该复合物继续激活下游的凝血因子X生成Xa，Xa激活凝血因子V并与其形成FXa-Va复合物，进而在钙离子和磷脂协助下，使促凝血酶原(Prothrombin)转变为具有生物活性的凝血酶。内源性和外源性的共同通路是从凝血因子X转化为激活的Xa开始。凝血酶的生成具有两个主要作用是：一方面可以转化纤维蛋白原(Fibrinogen,Fg)成为纤维素纤维(Fibrinfiber)，另一方面它还可以激活凝血因子XIII。激活后的XIIIa在纤维素纤维形成网状纤维血凝块的过程中，起着至关重要的作用。在心脏内科和血液内科的前期基础研究中，血栓凝块主要包括以下结构特征：纤维的直径、密度、分支点的数量、分支点之间的距离、孔径率本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种筛选用于促进骨愈合的药物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)提供纤维致密型的血凝块；(2)将待测物质与步骤(1)的血凝块混合，调节血凝块的结构；(3)如果步骤(2)中的血凝块的结构由纤维致密型变为纤维稀疏型，那么步骤(2)中的待测物质为促进骨愈合的药物。

【技术特征摘要】
1.一种筛选用于促进骨愈合的药物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)提供纤维致密型的血凝块；(2)将待测物质与步骤(1)的血凝块混合，调节血凝块的结构；(3)如果步骤(2)中的血凝块的结构由纤维致密型变为纤维稀疏型，那么步骤(2)中的待测物质为促进骨愈合的药物。2.如权利要求1所述的一种筛选用于促进骨愈合的药物的方法，其特征在于，所述纤维致密型的血凝块纤维密度高、纤维直径细；所述纤维稀疏型的血凝块纤维密度低、纤维直径粗。3.如权利要求1所述的一种筛选用于促进骨愈合的药物的方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：王信，
申请(专利权)人：遵义医学院附属医院，
类型：发明
国别省市：贵州,52