本发明专利技术提供了一种能够用于扩增和/或检测目标基因区域，如能够扩增及检测EGFR基因序列以及EGFR、KRAS和/或BRAF基因突变位点的多重PCR引物。利用该多重PCR引物，能够一次性高效检测EGFR/KRAS/BRAF基因突变位点，可同时覆盖EGFR、KRAS和/或BRAF基因上的多个外显子。
【技术实现步骤摘要】
同时获取以及检测多个目标区域序列的引物、试剂盒及方法相关申请本申请是申请日为2015年11月4日，名称为“一种基于下一代测序技术检测EGFR/KRAS/BRAF基因突变位点的多重PCR引物和方法及应用”的中国专利申请201510740906.1的分案。
本专利技术属于分子生物学领域，特别是涉及一种基于下一代测序技术检测EGFR、KRAS和/或BRAF基因突变位点的多重PCR引物和方法及应用。
技术介绍
表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)是位于7号染色体短臂上的原癌基因C-erbB-1(HER-1)的表达产物，是表皮生长因子受体家族(HER)中的4个成员之一，HER家族在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。EGFR酪氨酸激酶区域的突变主要发生在18～21号外显子，其中19和21号外显子突变占总突变的90％。EGFR信号传导的异常是导致多种肿瘤发生的原因。研究表明，EGFR在多种肿瘤中都有表达，如结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌和非小细胞肺癌等。K-ras基因是一种原癌基因，长约35kb，位于12号染色体短臂上，是ras基因家族成员之一，编码KRAS蛋白。K-ras基因常见的突变位点位于2号外显子的12号密码子和13号密码子上、3号外显子的6l号密码子，其中有7个突变热点：G12C、G12R、G12S、G12V、G12D、G12A、G13V/D，占K-ras基因总突变的98％以上。研究表明体细胞K-ras基因突变与多种人类恶性肿瘤，如肺癌、白血病、黏蛋白腺癌、胰腺癌、结直肠癌有关，而生殖细胞K-ras基因突变与努南综合征和心脏-面部-皮肤(cardio-facio-cutaneous，CFC)综合征相关。BRAF基因是一种原癌基因，定位于7号染色体上，编码丝/苏氨酸特异性激酶。约90％的BRAF基因突变发生在外显子15的1799位核苷酸上，T突变为A，导致缬氨酸被谷氨酸取代(V600E)。BRAF基因突变在黑色素瘤、结直肠癌、神经胶质瘤、肉瘤、卵巢癌、乳腺癌以及肺癌等肿瘤细胞系中的发生率依次为59％、18％、11％、9％、14％、2％、3％；此外，BRAFV600E在甲状腺乳头状癌中的发生率高达35.8％。BRAF基因突变是晚期及复发性结直肠癌最重要的预后指标之一，与患者较差的总体生存期密切相关。目前常见的检测这三个基因突变的方法有Sanger测序法和荧光定量PCR法。Sanger测序法中，单对引物可检测多个突变，但对多个基因、或同一基因的不同外显子上的突变位点就需分别进行扩增测序，操作繁琐，并且灵敏度较低约20％，假阴性率较高。荧光定量PCR法虽然灵敏度高，但每对引物只能检测一种突变，且每种突变需单独建立一个PCR反应体系，同时检测多个样本多个突变位点操作繁琐。这两种方法对样本的需要量都较大，不适合同时检测多个基因突变位点。
技术实现思路
鉴于此，本专利技术提供了一种多重PCR引物及应用。第一方面，本专利技术提供了一种多重PCR引物。该多重PCR引物由以下引物对组成：SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示引物对，SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示引物对，SEQIDNO:11和SEQIDNO:12所示引物对，以及SEQIDNO:17和SEQIDNO:18所示引物对。专利技术人基于目标序列特点多次设计，以及多次组合试验筛选，确定了这一组多重PCR引物，利用该多重PCR引物，能够一次性高效扩增获得EGFR上的多个外显子区域序列，继而能够用于检测EGFR上的多个外显子上的基因突变位点。其中的SEQIDNO:3和SEQIDNO:4引物对能够在同一反应体系中不受其它引物对影响地实现EGFR基因的外显子18的区域的扩增，SEQIDNO:7和SEQIDNO:8引物对能够在同一反应体系中不受其它引物对影响地实现EGFR基因的外显子19的区域的至少一部分的扩增，SEQIDNO:11和SEQIDNO:12引物对能够在同一反应体系中不受其它引物对影响地实现EGFR基因的外显子20的区域的至少一部分的扩增，SEQIDNO:17和SEQIDNO:18引物对能够在同一反应体系中不受其它引物对影响地实现EGFR基因的外显子21的区域的至少一部分的扩增。根据本专利技术的实施例，上述多重PCR引物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，该多重PCR引物还包括以下引物对中的至少一对：SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示引物对，SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示引物对，SEQIDNO:9和SEQIDNO:10所示引物对，SEQIDNO:13和SEQIDNO:14所示引物对，SEQIDNO:15和SEQIDNO:16所示引物对，SEQIDNO:19和SEQIDNO:20所示引物对，SEQIDNO:21和SEQIDNO:22所示引物对，SEQIDNO:23和SEQIDNO:24所示引物对，SEQIDNO:25和SEQIDNO:26所示引物对以及SEQIDNO:27和SEQIDNO:28所示引物对。根据本专利技术的实施例，该多重PCR引物还包括以上所列引物对中的两对、三对、五对或者全部十对。其中，SEQIDNO:1和SEQIDNO:2引物对能够在同一反应体系中不受其它引物对影响地实现EGFR基因的外显子18的区域的至少一部分的扩增，SEQIDNO:5和SEQIDNO:6引物对能够在同一反应体系中不受其它引物对影响地实现EGFR基因的外显子19的区域的至少一部分的扩增，SEQIDNO:9和SEQIDNO:10引物对以及SEQIDNO:13和SEQIDNO:14引物对能够在同一反应体系中不受其它引物对影响地实现EGFR基因的外显子20的区域的至少一部分的扩增，SEQIDNO:17和SEQIDNO:18引物对以及SEQIDNO:19和SEQIDNO:20引物对能够在同一反应体系中不受其它引物对影响地实现EGFR基因的外显子21的区域的至少一部分的扩增，SEQIDNO:21和SEQIDNO:22引物对能够在同一反应体系中不受其它引物对影响地实现KRAS基因的外显子2的区域的至少一部分的扩增，SEQIDNO:23和SEQIDNO:24引物对能够在同一反应体系中不受其它引物对影响地实现KRAS基因的外显子2的区域的至少一部分的扩增，SEQIDNO:25和SEQIDNO:26引物对能够在同一反应体系中不受其它引物对影响地实现BRAF基因的外显子15的区域的至少一部分的扩增，SEQIDNO:27和SEQIDNO:28引物对能够在同一反应体系中不受其它引物对影响地实现BRAF基因的外显子15的区域的至少一部分的扩增。根据本专利技术的实施例，所述多重PCR引物中，至少包括扩增EGFR、KRAS和BRAF基因中任意两个基因的引物对，所述引物对能够用于扩增所述基因的至少一个外显子区域。本领域技术人员可以理解，若多次设计摸索以及多次试验筛选确定的多重PCR引物组能够在同一反应体系中、同时互不干扰地实现目标片段的扩增，其中的任一部分引物组合也能于同一反应体系中发挥各自的功能，即互不影响地同时实现相应目标区域的扩增。根据本专利技术的实施例，所述多重PCR引物为SEQIDNO:1～SEQIDNO:28本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多重PCR引物，其特征在于，所述多重PCR引物由以下引物对组成：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示引物对，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示引物对，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示引物对，以及SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示引物对。
【技术特征摘要】
1.一种多重PCR引物，其特征在于，所述多重PCR引物由以下引物对组成：SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示引物对，SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示引物对，SEQIDNO:11和SEQIDNO:12所示引物对，以及SEQIDNO:17和SEQIDNO:18所示引物对。2.权利要求1所述的多重PCR引物，其特征在于，所述多重PCR引物还包括以下引物对中的至少一对：SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示引物对、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示引物对、SEQIDNO:9和SEQIDNO:10所示引物对、SEQIDNO:13和SEQIDNO:14所示引物对、SEQIDNO:15和SEQIDNO:16所示引物对、SEQIDNO:19和SEQIDNO:20所示引物对，SEQIDNO:21和SEQIDNO:22所示引物对，SEQIDNO:23和SEQIDNO:24所示引物对，SEQIDNO:25和SEQIDNO:26所示引物对以及SEQIDNO:27和SEQIDNO:28所示引物对。3.权利要求1或2任一所述的多重PCR引物在获得和/或检测EGFR基因序列以及在检测EGFR、KRAS和/或BRAF基因序列中的用途。4.一种试剂...
【专利技术属性】
技术研发人员：葛良进，邓力蔚，曾立董，刘松，李改玲，林群婷，刘丽春，
申请(专利权)人：深圳市瀚海基因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44
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