一种截短的重组褐藻胶裂解酶rAly1‑T185N及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种截短的重组褐藻胶裂解酶rAly1‑T185N及其编码基因与应用，一种截短的重组褐藻胶裂解酶rT185N，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述截短的重组褐藻胶裂解酶rT185N的编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术通过利用PCR技术对全长褐藻胶裂解酶Aly‑1的N端截掉185个氨基酸残基，获得了T185N截短酶；rT185N的表达量可达1259±2.2mg/L发酵液，比酶活可达2895±10.3U/mg，比全长蛋白rAly‑1的表达量调高了近2.6倍，实现了增产、节能、提高经济效益的目的，并且rT185N可通过镍柱分离实现该融合蛋白的一步纯化。

【技术实现步骤摘要】
一种截短的重组褐藻胶裂解酶rAly1-T185N及其编码基因与应用
本专利技术涉及一种截短的重组褐藻胶裂解酶rAly1-T185N及其编码基因与应用，属于基因工程技术和蛋白质表达

技术介绍
褐藻胶是由甘露糖醛酸(Mannuronate,M)及其C-5差像异构体古罗糖醛酸(Guluronate,G)通过糖苷键链接而成线性酸性多糖，分子内存在均一的聚M段、聚G段，以及杂合的MG或GM段。褐藻胶广泛存在于海带、马尾藻等药、食两用大型海洋褐藻的细胞壁和细胞间基质中。目前，日用化工、食品和医药领域应用的主体是海藻来源的褐藻胶。糖生物学的深入研究发现，褐藻胶寡糖具有重要生物学活性。例如，褐藻胶寡糖具有动态调节抗炎/促炎与抗氧化/促氧化、抑制α-葡萄糖苷酶活性等重要功能。聚M段褐藻胶寡糖具有成为抗阿尔兹海默综合症药物的潜力。综上，具有特定M/G比例和聚合度的褐藻胶寡糖具有重要应用价值和经济价值，实现这类寡糖的高效制备具有重要意义。褐藻胶裂解酶通过β-消去机制催化糖苷键的断裂，产生非还原性末端含不饱和共轭结构且在235nm附近具有特征吸收的系列寡糖产物。与化学或物理学降解方法相比，褐藻胶的酶法降解具有条件温和、易控制、环境污染小等优势特征，因而具有推广应用的潜质。通常内切酶可随机、高效降解多糖，生成聚合度不同的系列不饱和寡糖；外切酶可有序降解底物，专一性生成基本糖单元，供生物体吸收利用。由于褐藻胶是由M、G两种糖单元组成的，因此根据酶对底物的选择性以及酶的底物降解模式，通常可将褐藻胶裂解酶分为M-专一性内切酶、M-专一性外切酶、G-专一性内切酶、G-专一性外切酶、以及M/G-兼性内切酶、M/G-兼性外切酶等六大类。褐藻胶裂解酶主要来源于海螺的消化系统、海藻降解菌或病毒等。目前，关于褐藻胶裂解酶的专利申请和科研文献虽然数量较多，但主要集中于产酶菌株和酶的资源发掘等初级研究；酶的专一性分析多以纯度有限的聚M段、聚G段为测试底物，而关于酶的寡糖产物的结构特征分析缺少寡糖终产物的核磁共振波谱数据，关于寡糖生成特性即相应底物降解机制(如最小底物、最小产物、最小产物在底物中的生成位置以及酶的底物倾向性等)的阐释相对较少；分子酶学研究以基因克隆与异源表达、重组酶的纯化与功能鉴定为主，关于活性位点突变、功能模块截短等分子改造的研究较少。关于分子酶学改造与褐藻胶降解模式之间关系的规律性认知更少。综上，褐藻胶裂解酶的传统研究基础薄弱、深度不足，这导致与β-琼胶酶、纤维素酶等同类产品相比，少见商品化褐藻胶裂解酶的广泛应用，严重制约了寡糖酶法制备技术的发展。通常，褐藻胶裂解酶由一个催化模块结构域和一个或多个非催化区组成。催化结构域决定酶对褐藻胶底物的识别、结合与降解，从而决定该酶的生化特性；非催化区虽然不能降解褐藻胶，但对酶的催化性能可产生多方面的影响。最近，关于内切型褐藻胶裂解酶Aly2(来自Agarivoranssp.strainL11，兼性)和Aly5(也即AlgL-5，来自Flammeovirgasp.strainMY04，G专一性，专利文献CN104293754A，申请号201410469861.4)的研究表明，非催化区的存在可以帮助催化结构域更加有效地结合、降解小分子量的寡糖底物。然而差别在于，截短兼性的Aly2后，可有效地相对提高酶对聚M片段底物的倾向；但对G专一性的Aly5进行同样截短操作后，未见这种底物倾向性的显著变化。那么，为什么非催化区只能对这种兼性的褐藻胶裂解酶产生底物倾向性的影响，而对专一性的褐藻胶裂解酶基本没有影响？对于兼性的褐藻胶裂解酶，非催化区域又是如何影响催化区域进而改变底物倾向性的呢？目前，仅见相关实验现象的报道，未见详细机制的探讨。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种截短的重组褐藻胶裂解酶rAly1-T185N及其编码基因与应用。该截短的褐藻胶裂解酶Aly1-T185N(后文简称T185N)对原有的Aly-1(申请号201610838337.9)进行了分子改造，根据蛋白质分子内的非催化区域对催化区域功能的影响及特征，分析了相关的内在机制。本专利技术的技术方案如下：一种截短的重组褐藻胶裂解酶rT185N，将全长重组褐藻胶裂解酶Aly-1的N端截掉185个非催化氨基酸残基，构建得到T185N截短酶。上述截短的重组褐藻胶裂解酶rT185N，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。上述一种截短的重组褐藻胶裂解酶rT185N与全长蛋白rAly-1相比较，经异源表达，酶的产量提高，酶活增强，实现了增产、节能、提高经济效益的目的。相比之下，截短体rT185N的最适温度、pH和金属离子、化学试剂的影响等基本酶学基本性质无显著差异。但是，截短体rT185N所能降解寡糖底物的降解率、最适底物的M/G比例，以及底物切割模式等酶学特性出现了显著改变。与全长蛋白rAly-1相比:(1)截短后的重组酶rT185N既能降解来自褐藻胶的古罗糖醛酸寡糖片段，也能降甘露糖醛酸寡糖片段，仍然是兼性的褐藻胶裂解酶；(2)重组酶rT185N降解褐藻胶后仍然最终产生以不饱和二糖、不饱和三糖为主产物的系列寡糖产物，其摩尔比仍然接近1:1，其中:不饱和二糖终产物中几乎全部都是ΔG，不饱和三糖产物含有ΔG、ΔM等两种非还原性末端，且二者摩尔比接近5:8，表明含ΔM末端的三糖产物的含量提高了约17％；(3)重组酶rT185N降解大于三糖的系列不饱和寡糖、大于四糖的系列M寡糖或G寡糖时，采用经典的内切酶模式，其最小产物是二糖片段；(4)在降解M四糖或G四糖时，生成不饱和三糖产物，且伴生单糖产物。(5)在降解饱和M五糖或G五塘，rT185N可以从还原性末端或非还原性末端分别生成二糖产物，且最终主产物都是不饱和三糖产物。二者的显著区别在于，截短后的rT185N对不饱和四糖片段、饱和M四糖、饱和M五糖，以及荧光标记的饱和型聚M五糖(2AB-M5)、饱和型聚G四糖(2AB-G4)的降解率显著提高，但未见对饱和G四糖、饱和G五糖及更大寡糖底物的显著变化。特别值得注意的是，过量的全长酶rAly-1与荧光标记后的G四糖(2AB-G4)反应前后未产生变化，但rT185N可完全降解荧光标记的G四糖(2AB-G4)生成等摩尔量的2AB-UG3，并伴生饱和单糖。一种截短的重组褐藻胶裂解酶rT185N的编码基因，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。上述截短的重组褐藻胶裂解酶rT185N的编码基因，全长共780bp，所编码蛋白质含有259个氨基酸，分子量约为30.0kD。一种重组载体，在载体中插入了上述截短的重组褐藻胶裂解酶rT185N的编码基因。上述载体选自大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体。一种重组菌或转基因细胞系，在宿主细胞或细胞系中转入了上述重组载体。上述宿主细胞或细胞系选自大肠杆菌宿主细胞、酵母菌宿主细胞、枯草杆菌宿主细胞、乳酸菌宿主细胞、放线菌宿主细胞、丝状真菌宿主细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。用于重组表达截短的褐藻胶裂解酶rT185N的重组菌或转基因细胞系，可以是大肠杆菌宿主细胞(如EscherichiacoliBL21本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种截短的重组褐藻胶裂解酶rT185N，将全长重组褐藻胶裂解酶Aly‑1的N端截掉185个非催化氨基酸残基，构建得到。

【技术特征摘要】
1.一种截短的重组褐藻胶裂解酶rT185N，将全长重组褐藻胶裂解酶Aly-1的N端截掉185个非催化氨基酸残基，构建得到。2.如权利要求1所述的截短的重组褐藻胶裂解酶rT185N，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.一种截短的重组褐藻胶裂解酶rT185N的编码基因，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。4.一种重组载体，在载体中插入了权利要求3所述的截短的重组褐藻胶裂解酶rT185N的编码基因。5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述载体选自大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体或哺...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩文君，程媛媛，王丹丹，刘会会，古静燕，李福川，李新，卫洁，
申请(专利权)人：滕州市悟通香料有限责任公司，
类型：发明
国别省市：山东,37