一株枯草芽孢杆菌菌株及其饲料添加剂的应用与饲料制造技术

本发明专利技术公开了一种枯草芽孢杆菌新菌株DZS11，其保藏号为CGMCC No.11261。该菌株耐酸、耐胆盐，具有很高的产酶能力，特别是在淀粉酶能力测定中，与其他菌株相比具有明显的优势，通过动物实验发现其能有效促进畜禽的生产性能，可作为饲料添加剂和发酵剂应用于畜禽养殖中，应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】
一株枯草芽孢杆菌菌株及其饲料添加剂的应用与饲料
本专利技术属于微生物益生菌应用
，涉及一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)及其饲料添加剂的应用。
技术介绍
在畜禽养殖业中，抗生素等抗菌药物能有效的减少畜禽的发病率，提高畜禽等动物的生长效率而被广泛应用在畜禽的饲料中。同时由于人类长期滥用抗生素等药物，也严重影响了畜禽产品的发展。例如耐药性病原菌增加，畜禽产品的药物残留异常严重等问题。为食品安全和消费者的身体健康造成了一定程度的危害。对此欧盟已全面禁止饲料中使用抗生素促生长饲料添加剂。为了应对这些问题，采用益生菌微生物制剂来替代抗生素已成为当前畜禽养殖的热点。因此寻求安全、无残留的抗生素替代品迫在眉睫。通过研究发现益生菌饲料添加剂是一种十分理想的抗生素替代品，而且益生菌饲料添加剂具有天然无公害、无污染、质量稳定及效果明显等优点。特别是芽孢杆菌作为益生菌，其在生长代谢过程能产生多种酶，并且某些优良菌株还具有抑制有害菌的作用。但是，目前益生菌的研究和开发最关键的问题是优良菌株的选育，特别是优良芽孢杆菌的分离和筛选。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供一株优良特性的枯草芽孢杆菌及其在畜禽养殖中的应用。本专利技术提供了一株枯草芽孢杆菌，该菌株从仔猪粪便中分离经过初筛复筛得到，在LB培养基上菌落形态为菌落乳白色，圆形，湿润，表面光滑，边缘不整齐，不透明。菌体杆状，单个或成短链排列存在，革兰氏染色阳性菌株，产芽孢。利用细菌通用引物对筛选出的菌株进行16srDNAPCR扩增后鉴定，经NCBI序列比对结果相似性最高(100％)的是枯草芽孢杆菌，故分子鉴定DZS11为枯草芽孢杆菌。将该菌株命名为枯草芽孢杆菌DZS11(BacillussubtilisDZS11)，于2015年8月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCCNo.11261。本专利技术还提供包含该枯草芽孢杆菌的菌剂。在本专利技术一个实施方案中，所述菌剂为菌粉，所述菌粉还含有保护剂和/或载体。其中，所述菌剂的制备方法如下：将所述枯草芽孢杆菌进行发酵培养得到发酵液，所得菌液与保护剂和载体混合，在进风温度170-200℃，出风温度60-90℃的条件下，高温喷雾干燥得到菌剂。本专利技术还提供一种所述枯草芽孢杆菌的发酵方法，其包括如下步骤：按体积比为1％-5％的接种量向发酵培养基中接入培养16-22h的所述枯草芽孢杆菌种子液，发酵过程中控制pH7.0-7.5，发酵温度35-40℃，转速200-300rpm，通气比1:0.4，罐压0.05MPa。其中，所述的发酵培养基含有下述重量百分比的组分：玉米粉0.5％、豆饼粉1％、蔗糖0.4％、鱼粉0.6％、碳酸钙0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.2％、硫酸亚铁0.025％、硫酸锰0.025％。本专利技术还提供了含有所述的枯草芽孢杆菌的饲料添加剂。其中，所述枯草芽孢杆菌的的添加量为1×108-11CFU/g。本专利技术的枯草芽孢杆菌在用于饲料添加剂中，主要用于畜、禽或水产养殖的饲料添加剂，如：鸡、鸭、猪、牛、羊和鱼等的饲料添加剂。本专利技术还提供包含所述枯草芽孢杆菌的预混料或配合料。本专利技术的枯草芽孢杆菌DZS11，该菌株耐酸、耐胆盐，具有很高的产酶能力，特别是在淀粉酶能力测定中，与其他菌株相比具有明显的优势，通过动物实验发现其能有效促进畜禽的生产性能，可作为饲料添加剂和发酵剂应用于畜禽养殖中，应用前景广阔。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1枯草芽孢杆菌DZS11的筛选1、初筛采集仔猪粪便样品10份，分别称取10g土样，加入90mL无菌水制成菌悬液，经过80℃水浴中处理20min，于180r/min振荡30min，梯度稀释至合适梯度，涂布于LB培养基上，培养获得86株疑似芽孢杆菌。牛奶培养基(蛋白酶初筛用)：5g脱脂牛奶溶于50ml蒸馏水中；1.5g琼脂溶于50ml蒸馏水中，两液分别灭菌，待冷至45－50℃时，将两液混匀倒平板，即成牛奶平板。将平板倒置过夜，使表面水分干燥，然后将菌种点接在平板上混合倒板，过夜待用。配制该培养基时，切勿将牛奶和琼脂混合灭菌，以防牛奶凝固。淀粉水解平板(淀粉酶初筛用)：LB培养基，其中加入0.2％的可溶性淀粉，灭菌后倒平板。生理盐水的配置方法是：0.85％的氯化钠，高压蒸汽灭菌后备用。人工胃液的配置方法是：1％胃蛋白酶，0.85％的氯化钠，用盐酸调节pH到2.0，过滤除菌备用。LB固体培养基制作方法是：蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母膏5g，琼脂2％，pH7.0，高压蒸汽灭菌后备用。LB液体培养基制作方法是：蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母膏5g，pH7.0，高压蒸汽灭菌后备用。人工胆盐的配置方法是：在LB液体培养基中添加0.3％的猪胆盐，高压蒸汽灭菌后备用。2、复筛(1)平板菌落计数法检测DZS11菌粉的活菌数约为1010CFU/g。(2)菌株DZS11产淀粉酶能力测定将通过初筛过程得到的目标菌株点接于淀粉水解平板，37℃培养24h，加入路哥氏碘液染色1min后观察透明圈直径与菌体直径比，初步测定淀粉酶活力。将淀粉酶较高菌株接种于发酵培养基37℃振荡培养24-48h，取2到3个时间点的发酵培养液离心取上清液检测淀粉酶和糖化酶活力，对菌株的淀粉酶活力进行复筛。淀粉酶活力测定方法用GB/T18932.16-2003进行测定。经过初筛获得一株透明圈直径与菌体直径比最大的菌株，命名为DZS11。经过淀粉酶活力定量测定菌株DZS11的淀粉酶活力为3285.87U(淀粉酶在40℃下每ml菌液1h内水解1ml的1％淀粉，定义为1个淀粉酶活力单位)。(3)菌株DZS11产蛋白酶能力测定将通过初筛过程得到的目标菌株点接于牛奶平板，37℃培养24h，菌落周围出现透明圈，直接观察透明圈直径与菌体直径比，初步测定蛋白酶活力。将蛋白酶较高菌株接种于发酵培养基37℃振荡培养24-48h，取2到3个时间点的发酵培养液离心取上清液检测蛋白酶活力，对菌株的蛋白酶活力进行复筛。蛋白酶活力测定方法用GB/T28715-2012进行测定。同时经过蛋白酶初筛比较发现，DZS11菌株的蛋白酶活力也比较高。经过蛋白酶活力定量测定菌株DZS11的中性蛋白酶活力为65.9U(蛋白酶在pH7.2时，40℃下每分钟水解酪蛋白产生lug酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位)，酸性蛋白酶活力为41.6U(蛋白酶在pH3.0时，40℃下每分钟水解酪蛋白产生lug酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位)。此菌株和实验室其他有效益生菌株及某些国内外产品分离菌株(国内3-1是从蔚蓝某产品分离得到的，国外K1是从科汉森某产品分离得到的)的产淀粉酶活力及产蛋白酶活力比较如下表1所示：表1：部分实验室枯草芽孢杆菌菌株酶活测定(4)人工胃液的耐受能力测定将1gDZS11菌粉溶于9ml灭菌的生理盐水中，振荡混匀后，用稀释涂布平板法计数。取上述菌液1ml加入9ml人工胃液中，37℃静置2小时，稀释涂布平板法计数，残存活菌浓度与原菌浓度之比为90.2％，从上述实验可以看出该菌能较好地在人工胃液中生存。(5)人工胆盐本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株，其保藏号为CGMCC No.11261。

【技术特征摘要】
1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)菌株，其保藏号为CGMCCNo.11261。2.含有权利要求1所述菌株的菌剂。3.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，其为菌粉，所述菌粉还含有保护剂和/或载体。4.如权利要求3所述的菌剂，其特征在于，其制备方法如下：将所述枯草芽孢杆菌进行发酵培养得到发酵液，所得发酵液与保护剂和载体混合，在进风温度170-200℃，出风温度60-90℃的条件下，高温喷雾干燥得到菌剂。5.一种发酵权利要求1所述菌株的方法，其包括如下步骤：按体积比为1％-5％的接种量向发酵培养基中接入培养16-22h的所述枯草...

【专利技术属性】
技术研发人员：解林奇，白秀梅，宋潇，吴栋，
申请(专利权)人：北京大北农科技集团股份有限公司，漳州大北农农牧科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11