一种快速测定雨生红球藻孢子破壁率的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速测定雨生红球藻孢子破壁率的方法，其步骤是：A、丙酮提取、测定已知样品的虾青素吸光度，B、对已知样品研磨、匀浆使其破壁率达到100%后用丙酮提取、测定100%破壁样品的虾青素吸光度，丙酮提取、测定已知样品的虾青素吸光度（吸光值A1）和对已知样品研磨、匀浆使其破壁率达到100%后用丙酮提取、测定100%破壁样品的虾青素吸光度（吸光值A2）的比例，即孢子破壁率；本发明专利技术方法操作仅须三个步骤，操作简单、计算简便（不需要算出虾青素的实际含量，仅需将2个样品吸光度A1和A2相除得到对应的比例结果）、高效快捷（全过程约15-20分钟），非常适合雨生红球藻制品生产加工过程的实时监控和质量控制。

A method for rapid determination of wall broken rate of rain grown red alga

The invention discloses a method for rapid determination of haematococcuspluvialis spores broken rate, which comprises the steps of: A, acetone extraction and determination of known samples of astaxanthin absorbance, B, to make it known sample grinding, homogenate broken rate reached 100% after acetone extraction and determination of 100% Ganoderma samples of astaxanthin was extracted by acetone determination of astaxanthin, known sample absorbance (OD value A1) and grinding, the known samples were broken rate reached 100% after acetone extraction and determination of 100% Ganoderma samples of astaxanthin absorbance (OD value A2) the proportion of the spore wall broken rate; the method of the invention has only three steps, operation simple and easy to calculate (only the actual content, does not need to calculate the astaxanthin 2 absorbance A1 and A2 corresponding to the proportion of the Division) and high (the whole process about 15-20 minutes ), is very suitable for real-time monitoring and quality control of production processes of haematoccuspluvialis products.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微藻检测的生物
，尤其是涉及一种快速测定雨生红球藻孢子破壁率的方法。
技术介绍
虾青素（Astaxanthin），化学名称为3,3'-二羟基-β,β-胡萝卜素-4,4'-二酮，分子式为C40H52O4，是一种酮式类胡萝卜素，其天然产物多数以酯的形式存在，具有非水溶性和亲脂性，易溶于二硫化碳、丙酮、苯和氯仿等有机溶剂。雨生红球藻是世界上公认的最富含虾青素的原料，其虾青素含量可达细胞干重的5%以上，是天然抗氧化剂的浓缩品。此外，雨生红球藻含有丰富的蛋白质、多糖、维生素、微量元素和天然色素等营养成分，而在全球备受瞩目，其价值被广泛应用于医药、化妆品、健康食品，是目前科学界发现的继螺旋藻、小球藻之后，新一代藻类食品。根据《中华人民共和国食品安全法》和《新资源食品管理办法》的规定，2010年卫生部批准雨生红球藻为新资源食品（中华人民共和国卫生部第17号公告），允许作为普通食品生产和经营，同时可作为提取天然虾青素的原料。雨生红球藻（Haematococcuspluvialis)属于团藻目，红球藻科，是一种广泛存在的淡水单细胞绿藻。雨生红球藻通常为有两根鞭毛可以自行游动的营养细胞(vegetative)，细胞周围有透明多糖类的凝胶状的柔软细胞壁。当它处在不利环境时（如强紫外线,或营养缺乏、温度变化等），细胞受到环境胁迫形成厚壁孢子（Cyst）并大量累积虾青素，形成对自我机体的保护。（BoussibaetaL1992）。含有虾青素的雨生红球藻的厚壁孢子具有坚韧的细胞壁，若直接利用，其生物有效利用率低，且坚韧的细胞壁会阻碍有机溶剂进入细胞内提取虾青素[5]。因此在无论是直接食用，或者提取虾青素前必须对孢子态细胞进行破壁处理，破坏雨生红球藻的细胞壁结构，以促进虾青素的提取和生物利用率。雨生红球藻的破壁率是雨生红球藻产品生物利用率的一个重要指标；也是作为工业化提取虾青素的重要生产指标。目前，我国雨生红球藻行业是一个新兴的行业，尚无完善的检测方法和质量标准。建立完善和有效的检测方法，是促进雨生红球藻行业发展的基本要求。雨生红球藻的破壁的原因有两种：（1）培养过程中由于物理、化学、生物污染等问题导致的雨生红球藻破壁，其结果为红球藻细胞死亡，细胞内的虾青素含量下降，并在一段时间内完全降解，此类细胞破坏的红球藻没有市场价值；（2）为了提取、加工雨生红球藻产品而设计的主动破壁工艺生产的破壁雨生红球藻细胞，此类工艺短暂停留后经过后加工处理，虾青素保留完整不损耗，是目前破壁雨生红球藻细胞的主要价值所在。目前，雨生红球藻的破壁率测定方法包括：1、细胞计数法：利用“平板计数框”在显微镜下对破壁前后的细胞进行计数统计，再根据公式计算破壁率：R=（细胞总数-破壁后剩余细胞数）/细胞总数；由于是人工计数，计数单位较小且须在显微镜下进行，此法容易造成巨大误差，难于用作定量分析使用。2、专利《雨生红球藻孢子破壁率的测定方法》（公开号CN101609039A）中公开了一种溶剂法测定方法：此方法原理主要是利用了二氯甲烷-正己烷混合溶液和二甲基亚砜（DMSO）溶液对雨生红球藻破壁和未破壁细胞中的虾青素溶解度不同，从而进行2次测定进行结果比较计算雨生红球藻的破壁率；但存在以下问题：（1）上述专利的原理主要在于二甲基亚砜能提取出未破壁的雨生红球藻中的虾青素，其方法需要建立在准确测定虾青素的含量的基础上；但实际应用发现，二氯甲烷、正己烷、二甲基亚砜虽然都属于亲酯性有机溶剂，能够穿透未破壁的雨生红球藻孢子胞壁进入细胞，但细胞内的天然虾青素90%以上却以酯化形式存在（约70%的单酯、25%的双酯及5%的单体），酯化分子较大，而完整孢子壁厚而坚固，其内部的虾青素难以全部通过细胞壁被萃取出来，因此，上述专利方法在70℃下不能完全提取完整红球藻细胞中的虾青素，容易造成较大误差；（2）二甲基亚砜提取效率受雨生红球藻质量干扰较大，对于不同批次生产的雨生红球藻其测定结果不稳定，难以适应大规模生产时质量检测的可靠性；（3）雨生红球藻细胞中除虾青素外，还含有大量的叶绿素、黄色素等杂质，容易被二甲基亚砜等溶剂提取，而其测定时的吸光度与虾青素吸光度接近，其测定结果容易受到这些杂质的干扰造成测定误差；（4）上述专利采用了两种溶剂（二氯甲烷-正己烷混合溶液和二甲基亚砜），这两种溶剂对于虾青素的吸收波长有差异，但都以相同DMSO为对照在530nm测定的吸光度不匹配，易导致最终计算破壁率的误差，不利于质量控制过程的准确性和有效性；（5）有机溶剂能使天然虾青素异构化降解，而且在碱性条件下，易发生不可逆的变性；（6）正己烷-二氯甲烷属于非极性与水互不溶，如果样品原料中含水量高，就无法与样品充分接触，无法萃取出色素。而实际破壁加工过程含有大量水分，若干燥处理后再分析，增加处理成本，且散失了实时质量控制的意义。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供一种准确、高效、稳定、易操作的雨生红球藻孢子破壁率的检测方法，本方法能够定量有效地反映雨生红球藻产品在生产、加工、销售过程中的破壁效率，尤其为雨生红球藻制品提供了质量控制和监控的可靠的技术检测方法。本专利技术的原理是：丙酮在常温常压下可以完全萃取雨生红球藻破壁孢子中的虾青素，而不能萃取出完整的红球藻孢子中的虾青素，用紫外分光光度计（最大吸收波长475nm）测定雨生红球藻虾青素的含量，丙酮在未完全破壁雨生红球藻孢子中萃取出的虾青素含量和雨生红球藻中总虾青素含量的比值，即为雨生红球藻孢子的破壁率。根据虾青素含量的计算公式，破壁率的计算为2个虾青素含量公式相除，实际操作中不需要计算虾青素的含量，只需要计算测定虾青素的吸光度，计算其比值即可。一种快速测定雨生红球藻孢子破壁率的方法，其步骤是：包括丙酮提取、测定已知样品的虾青素吸光度（吸光值A1），对已知样品研磨、匀浆使其破壁率达到100%后用丙酮提取、测定100%破壁样品的虾青素吸光度（吸光值A2）两个测量步骤，和一个计算步骤；其特征在于：A、丙酮提取、测定已知样品的虾青素吸光度：雨生红球藻样品包括鲜藻、藻浆、藻粉及含藻浆或藻粉的雨生红球藻制品（如藻片、胶囊等），丙酮的分析纯≥99.5%；精确称取定量雨生红球藻样品置于100ml容量瓶中，加入丙酮100ml定容至刻度，在室温（20-25℃）下萃取5-15分钟，充分振荡使虾青素充分析出，将上述溶液转移至离心管，用3500-5000rpm离心2-5分钟，使溶液和藻渣分离，取离心后上清液5ml转移至100ml容量品，丙酮定容至100ml（即稀释20倍），用紫外分光光度计（1cm光径比色杯，以丙酮为空白对照溶液）测量475nm波长光吸光度A1；B、对已知样品研磨、匀浆使其破壁率达到100%后用丙酮提取、测定100%破壁样品的虾青素吸光度：雨生红球藻样品包括鲜藻、藻浆、藻粉及含藻浆或藻粉的红球藻制品（如藻片、胶囊等），丙酮的分析纯≥99.5%；精确称取定量雨生红球藻样品（上述相同样品）置于试管分散机中，加入少量丙酮（2-5ml），5000-10000rpm研磨5分钟（或组织匀浆机10000-15000转匀浆5分钟或充分研磨），将分散试管内的混合样品转移至100ml容量瓶中，用丙酮将附着的色素完全洗脱直至无色，并将全部液体转移到容量瓶中，加入丙酮10本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速测定雨生红球藻孢子破壁率的方法，其步骤是：A、丙酮提取、测定已知样品的虾青素吸光度：精确称取定量雨生红球藻样品置于100ml容量瓶中，加入丙酮100ml定容至刻度，在室温（20‑25℃）下萃取5‑15分钟，充分振荡使虾青素充分析出，将上述溶液转移至离心管，用3500‑5000rpm离心2‑5分钟，使溶液和藻渣分离，取离心后上清液5ml转移至100ml容量品，丙酮定容至100ml（即稀释20倍），用紫外分光光度计（1cm光径比色杯，以丙酮为空白对照溶液）测量475nm波长光吸光度A1；B、对已知样品研磨、匀浆使其破壁率达到100%后用丙酮提取、测定100%破壁样品的虾青素吸光度：精确称取定量雨生红球藻样品（上述相同样品）置于试管分散机中，加入少量丙酮（2‑5ml），5000‑10000rpm研磨5分钟（或组织匀浆机10000‑15000转匀浆5分钟或充分研磨），将分散试管内的混合样品转移至100ml容量瓶中，用丙酮将附着的色素完全洗脱直至无色，并将全部液体转移到容量瓶中，加入丙酮100ml定容至刻度，在室温（20‑25℃）下萃取5‑15分钟，充分振荡使虾青素充分析出，将上述溶液转移至离心管，用3500‑5000rpm钟离心2‑5分钟，使溶液和藻渣分离，取离心后上清5ml转移至100ml容量品，丙酮定容至100ml（稀释20倍），用紫外分光光度计（1cm光径比色杯，以丙酮为空白对照溶液）测量475nm波长光吸光度A2；C、计算孢子破壁率丙酮提取、测定已知样品的虾青素吸光度（吸光度值A1）和对已知样品研磨、匀浆使其破壁率达到100%后用丙酮提取、测定100%破壁样品的虾青素吸光度（吸光度值A2）的比例，即孢子破壁率；用公式计算孢子破壁率（A）：A = A1/A2×100%。...

【技术特征摘要】
1.一种快速测定雨生红球藻孢子破壁率的方法，其步骤是：A、丙酮提取、测定已知样品的虾青素吸光度：精确称取定量雨生红球藻样品置于100ml容量瓶中，加入丙酮100ml定容至刻度，在室温（20-25℃）下萃取5-15分钟，充分振荡使虾青素充分析出，将上述溶液转移至离心管，用3500-5000rpm离心2-5分钟，使溶液和藻渣分离，取离心后上清液5ml转移至100ml容量品，丙酮定容至100ml（即稀释20倍），用紫外分光光度计（1cm光径比色杯，以丙酮为空白对照溶液）测量475nm波长光吸光度A1；B、对已知样品研磨、匀浆使其破壁率达到100%后用丙酮提取、测定100%破壁样品的虾青素吸光度：精确称取定量雨生红球藻样品（上述相同样品）置于试管分散机中，加入少量丙酮（2-5ml），5000-10000rpm研磨5分钟（或组织匀浆机10000-15000转匀浆5分钟或充分研磨），将分散试管内的混合样品转移至100ml容量瓶中，用丙酮将附着的色素完全洗脱直至无色，并将全部液体转移到容量瓶中，加入丙酮100ml定容至刻度，在室温（20-25℃）下萃取5-15分钟，充分振荡使虾青素充分析出，将上述溶液转移至离心管，用3500-5000rpm钟离心2-5分钟，使溶液和藻渣分离，取离心后上清5ml转移至100ml容量品，丙酮定容至100ml（稀释20倍），用紫外分光光度计（1cm光径比色...

【专利技术属性】
技术研发人员：骆野鸣，
申请(专利权)人：骆野鸣，
类型：发明
国别省市：云南;53