传染性法氏囊病毒抗原偶联磁性微粒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了传染性法氏囊病毒抗原或其片段偶联磁性微粒及其制备方法和应用。具体地，涉及一种传染性法氏囊病毒抗原偶联的磁性微粒的制备方法，其特征在于，包括步骤：(a)提供磁性微粒溶液、和传染性法氏囊病毒抗原或其片段；(b)将(a)中的磁性微粒溶液和传染性法氏囊病毒抗原或其片段进行混合得到磁性微粒溶液和传染性法氏囊病毒抗原或其片段相偶联的混合液，磁性微粒溶液和传染性法氏囊病毒抗原或其片段的混合比例为5‑15mg：0.5‑10nmol。本发明专利技术方法获得了包被均质、结构稳定的传染性法氏囊病毒抗原或其片段偶联磁性微粒，其检测范围较宽，灵敏度较高、反应时间非常短，并具有高通量、自动化、可重复的优异特点。

Infectious bursal virus antigen conjugated magnetic particle, preparation method and application thereof

The present invention provides infectious bursal disease virus antigen or fragment thereof coupled magnetic particle, preparation method and application thereof. Specifically, preparation method of magnetic particles relates to an infectious bursal disease virus antigen coupling, characterized by comprising the steps of: (a) providing magnetic particles solution, and infectious bursal disease virus antigen or a fragment thereof; (b) (a) of the magnetic particles in solution and dyeing method IBDV antigen or its fragments were a mixture of magnetic particles and solution of infectious bursal disease virus antigen or a fragment thereof is coupled, mixing ratio of magnetic particles and solution of infectious bursal disease virus antigen or a fragment thereof is 5 15mg:0.5 10nmol. The method of the invention won the infectious bursal disease virus antigen was stable and homogeneous structure, or its fragment coupling of magnetic particles, which has wide measuring range, high sensitivity, response time is very short, and has excellent characteristics of high throughput, automated, repeatable.

【技术实现步骤摘要】
传染性法氏囊病毒抗原偶联磁性微粒及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物检测领域。具体地，涉及一种传染性法氏囊病毒抗原偶联磁性微粒及其制备方法和应用。
技术介绍
鸡传染性法氏囊病(Infectiousbursaldisease；IBD)又称鸡传染性腔上囊病，是由传染性法氏囊病毒(Infectiousbursaldiseasevirus；IBDV)引起的一种急性、接触传染性疾病。传染性法氏囊病毒属于双RNA病毒科，包括两个血清型。以法氏囊发炎、坏死、萎缩和法氏囊内淋巴细胞严重受损为特征。从而引起鸡的免疫机能障碍，干扰各种疫苗的免疫效果。发病率高，几乎达100％，死亡率低，一般为5％～15％，是目前养禽业最重要的疾病之一。雏鸡易发病，2～3天内可波及60％～70％的鸡，发病后3～4天死亡达到高峰，7～8天后死亡停止。病初精神沉郁，采食量减少，饮水增多，有些自啄肛门，排白色水样稀粪，重者脱水，卧地不起，极度虚弱、最后死亡。耐过雏鸡贫血消瘦，生长缓慢。剖检可见：法氏囊发生特征性病变，法氏囊呈黄色胶胨样水肿、质硬、粘膜上覆盖有奶油色纤维素性渗出物。有时法氏囊粘膜严重发炎，出血，坏死，萎缩。另外，病死鸡表现脱水，腿和胸部肌肉常有出血，颜色暗红。肾肿胀，肾小管和输尿管充满白色尿酸盐。脾脏及腺胃和肌胃交界处粘膜出血。传染性法氏囊抗原VP2蛋白是主要的中和性抗原蛋白，其抗体是疫苗免疫后抗体水平的监测和病毒感染后抗体水平检测的主要标的，抗体水平高低与其免疫或感染状况直接相关，通过抗体水平的监测来制定合理、有效的免疫程序是提高群体免疫水平的保证。现有的检测机构有兽医站、疫苗公司、养殖场等存在着大量的样本，也对大通量的传染性法氏囊抗体检测试剂盒和仪器有着需求。目前建立并应用的传染性法氏囊抗体检测方法有琼扩试验、ELISA、病毒中和试验、胶体金试纸条等方法，其中琼扩试验目前是传染性法氏囊抗体检测最常用的方法，通过倍比稀释抗体血清和抗原观察是否发生沉淀判断抗体滴度；ELISA试验较为灵敏，但难以定量；病毒中和试验是通过传染性法氏囊病毒和抗体在细胞上中进行抗原抗体反应来判定抗体滴度，能较全面反映中和抗体的高低，全过程为病毒滴定、抗体中和、结果判定等过程需5-7天时间，全过程只能人工来操作、判定，重复性差；胶体金方法能快速得出结果，但是只能定性，难以定量，限制了应用范围。现有的琼扩试验、ELISA、病毒中和试验、胶体金等的方法难以满足。因此，本领域迫切需要开发一种高灵敏度、高准确性、花费时间较短的检测方法。
技术实现思路
本专利技术第一方面，提供了一种传染性法氏囊病毒抗原偶联的磁性微粒的制备方法，包括步骤：(a)提供磁性微粒溶液、和传染性法氏囊病毒抗原或其片段；(b)将(a)中的磁性微粒溶液和传染性法氏囊病毒抗原或其片段进行混合得到磁性微粒溶液和传染性法氏囊病毒抗原或其片段相偶联的混合液，其中，磁性微粒溶液和传染性法氏囊病毒抗原或其片段的混合比例为5-15mg：0.5-10nmol，较佳地，5-10mg：1-8nmol，更佳地，8-10mg：1.2-5mg，例如，1.1-2.27nmol。在另一优选例中，所述步骤(b)中还包括步骤(b’)：向所述的混合液中加入交联剂和/或催化剂，从而获得经交联和/或经催化的混合液。所述步骤(b)中还包括步骤(b”):向所述的混合中加入标记物，从而获得经标记的混合液。在另一优选例中，所述的传染性法氏囊病毒抗原或其片段包括VP2蛋白或其片段。在另一优选例中，所述标记物包括发光标记物，例如，光激发发光标记物、电激发发光标记物。在另一优选例中，所述的发光标记物包括吖啶酯、碱性磷酸酶、和/或过氧化物酶。在另一优选例中，还包括步骤(c)：向(b)所获得的混合液中加入封闭剂。在另一优选例中，所述的磁性微粒与所述的传染性法氏囊病毒抗原或其片段的结合方式包括直接偶联和间接偶联。在另一优选例中，所述的间接偶联包括通过以下方式介导的偶联：链霉亲和素-生物素介导的偶联、抗FITC抗体-FITC偶联。在另一优选例中，所述的直接偶联包括通过磁性微粒羧基与蛋白氨基缩合形成酰胺、磁性微粒氨基与蛋白氨基通过戊二醛交联形成五碳桥、或甲苯磺酰基磁性微粒与蛋白氨基共价偶联相连接。在另一优选例中，所述的磁性微粒核心为氧化铁。在另一优选例中，所述的磁性微粒还含有活性基团。在另一优选例中，所述的活性基团包括羟基、羧基、磺酰基或氨基活性基团。在另一优选例中，所述的磁性微粒的粒径为0.1-5μm，优选地为1-3μm。在另一优选例中，所述的磁性微粒溶液中,磁性微粒粒径CV<3％。在另一优选例中，所述传染性法氏囊病毒抗原或其片段包括：传染性法氏囊病毒全长、天然传染性法氏囊病毒片段、重组表达的传染性法氏囊病毒全长、重组表达的传染性法氏囊病毒片段，传染性法氏囊病毒多肽、或传染性法氏囊病毒化学合成物。在另一优选例中，所述传染性法氏囊病毒VP2蛋白的全长序列如SEQIDNO.:1所示。在另一优选例中，所述传染性法氏囊病毒VP2蛋白片段的序列如SEQIDNO.:2所示。在另一优选例中，所述传染性法氏囊病毒VP2蛋白多肽片段的序列如SEQIDNO.:3所示。在另一优选例中，所述方法包括步骤：(a)提供磁性微粒溶液、和传染性法氏囊病毒抗原或其片段；(b)将(a)中的磁性微粒溶液和传染性法氏囊病毒抗原或其片段进行混合得到混合液，其中，磁性微粒溶液和传染性法氏囊病毒抗原或其片段的混合比例为10mg：0.6-9.5nmol；(b’)向(b)中加入交联剂或催化剂，从而得到经交联或催化的混合液；(b”)向(b’)经交联或催化的混合液中加入封闭剂。本专利技术第二方面，提供了一种传染性法氏囊病毒抗原偶联的磁性微粒，其中，磁性微粒溶液和传染性法氏囊病毒抗原或其片段的比例为5-15mg：0.5-10nmol，较佳地，5-10mg：1-8nmol，更佳地，8-10mg：1.2-5nmol，例如，10mg：1.1-2.27nmol。在另一优选例中，所述传染性法氏囊病毒抗原偶联的磁性微粒由本专利技术第一方面所述的方法制成。本专利技术第三方面，提供了本专利技术第二方面所述传染性法氏囊病毒抗原偶联的磁性微粒的用途，用于制备检测传染性法氏囊抗体的检测试剂和/或试剂盒。本专利技术第四方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒含有容器和说明书，所述的容器内含有本专利技术第二方面所述的传染性法氏囊病毒抗原偶联的磁性微粒。在另一优选例中，所述的容器内还含有独立包装的质控品或校准品、或清洗液。在另一优选例中，所述校准品包括传染性法氏囊病毒抗体阴性或阳性血清稀释液。在另一优选例中，所述清洗液包括含有Tween20的Tris缓冲液或含有Tween20的PBS缓冲液。在另一优选例中，所述Tween20的Tris缓冲液浓度为0.05mol/L，pH为8.0。在另一优选例中，所述Tween20的PBS缓冲液浓度为0.05mol/L，pH为7.0。在另一优选例中，所述的说明书记载了含有本专利技术第二方面所述的传染性法氏囊病毒抗原偶联的磁性微粒的使用方法，包括步骤：(i)提供待测样品、和所述传染性法氏囊病毒抗原偶联的磁性微粒；(ii)将所述待测样品与所述传染性法氏囊病毒抗原偶联的磁性微粒混合并进行反应；(iii)将(ii)中反应后的混合液进行洗涤本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种传染性法氏囊病毒抗原偶联的磁性微粒的制备方法，其特征在于，包括步骤：(a)提供磁性微粒溶液、和传染性法氏囊病毒抗原或其片段；(b)将(a)中的磁性微粒溶液和传染性法氏囊病毒抗原或其片段进行混合得到磁性微粒溶液和传染性法氏囊病毒抗原或其片段相偶联的混合液，其中，磁性微粒溶液和传染性法氏囊病毒抗原或其片段的混合比例为5‑15mg：0.5‑10nmol。

【技术特征摘要】
1.一种传染性法氏囊病毒抗原偶联的磁性微粒的制备方法，其特征在于，包括步骤：(a)提供磁性微粒溶液、和传染性法氏囊病毒抗原或其片段；(b)将(a)中的磁性微粒溶液和传染性法氏囊病毒抗原或其片段进行混合得到磁性微粒溶液和传染性法氏囊病毒抗原或其片段相偶联的混合液，其中，磁性微粒溶液和传染性法氏囊病毒抗原或其片段的混合比例为5-15mg：0.5-10nmol。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中还包括步骤(b’)：向所述的混合液中加入交联剂和/或催化剂，从而获得经交联和/或经催化的混合液；和/或所述步骤(b)中还包括步骤(b”):向所述的混合中加入标记物，从而获得经标记的混合液。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磁性微粒与所述的传染性法氏囊病毒抗原或其片段的结合方式包括直接偶联和间接偶联。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磁性微粒还含有活性基团。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述传染性法氏囊病毒抗原或其片段包括：传染性法氏囊病毒全长、天然传染性法氏囊病毒片段、重组表达的传染性法氏囊病毒全长、重组表达的传染性法氏囊病毒片段，传染...

【专利技术属性】
技术研发人员：左青山，宋启超，李炎晖，刘聪，纪良心，
申请(专利权)人：上海鸣捷生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31