性能改善的抑肽酶制造技术

本发明专利技术涉及具有改进的酰－抑制性质、免疫学性质和药物动力学性质的抑肽酶变异体及其制品。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及具有改善的酶抑制活性、免疫学性质和药物动力学性质的抑肽酶变异体及其制备。抑肽酶也称为牛胰蛋白酶抑制剂(BPTI)，属于Kunitz类型丝氨酸蛋白酶抑制剂家族。可抑制的丝氨酸蛋白酶的范围包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、纤维蛋白溶酶和血浆血管舒缓素(W.Gebhard，H.Tschesche and H.Fritz，Proteinase Inhibitors，Barrett and Salvesen(eds.)，Elsevier Science Publ.BV 375-387，1986)。抑肽酶由58个氨基酸组成。借助于X-射线结构分析和NMR光谱分析，阐明了蛋白质的三级结构(Wlodawer et al.，J.Mol.Biol.198(3)，469-480，1987；Wager et al.，J.Mol.Biol.196(1)，227-231，1987；Berndtet al.，Biochemistry 32(17)，4564-4570，1993)。商品名为Trasylol的天然抑肽酶最初用于胰腺炎的治疗。今天Trasylol用于心脏外科，因为临床研究表明，用抑肽酶进行治疗显著降低该类型手术中输血的需要，并减少术后出血(D.Royston，J.Cardiothorac.Vasc.Anesth.676-100，1992)。有迹象表明，在决定抑制特异性的15位氨基酸的置换可产生具有改善的抑制性质的有用的抑肽酶变异体(德国专利说明书3339693)。这样，根据导入的氨基酸不同，可以产生例如可抑制胰腺或白细胞弹性蛋白酶的各种有效抑制剂。还有迹象表明，抑肽酶抑制活性以及在第15位置换产生的变异体们的抑制活性还由被抑制的靶蛋白酶与抑制剂分子之间接触区中的氨基酸残基所决定。这些氨基酸尤其包括在第14、16、17、18、19、34、38和39位上的其它氨基酸残基。在以下专利申请例如WO89/01968、WO89/10374、EP 0307592、EP 683229中描述了其中包括由于在接触区中置换一个或多个氨基酸残基产生的性能改善的抑肽酶变异体。有趣的是，通过置换确定物质物化性质的氨基酸，可能改进抑肽酶及其变异体的药物动力学性质。因此通过降低分子的净正电荷可能显著降低肾脏的结合。专利申请WO92/06111中描述了该类型的变异体。为了提高工业的制备性，在某些情况下最好进行抑制分子的N-末端修饰。这类修饰可以是N-末端收缩或延伸，或是缺失一个或多个氨基酸。EP 419878中描述了N-末端修饰的抑肽酶变异体。本专利技术的抑肽酶变异体本专利申请中描述的抑肽酶变异体的区别在于以下特征1.置换分子活性中心的一个或多个氨基酸，以改进活性性质。2.置换氨基酸降低净正电荷，以改进免疫学性质和药物动力学性质。3.修饰N-末端氨基酸序列，以改进工业制备性。上述专利申请中描述的每个抑肽酶变异体只含有其中一个上述特征。现在，本专利技术的抑肽酶变异体在其分子结构中结合了两个或三个上述特征。图中举例显示了某些变异体的氨基酸序列。然后，本专利技术的抑肽酶变异体不限于附图说明图1所示的实例。本专利技术抑肽酶变异体也包括具有N-末端延伸Ala(-2)-Gln(-1)的变异体、在2位具有中性氨基酸残基脯氨酸的变异体、由中性或带负电荷的氨基酸残基置换带正电荷的氨基酸的变异体、或由带负电荷的氨基酸残基置换中性氨基酸的变异体。这里氨基酸残基置换的选择按照以下原则进行产生的物质在生理pH下净正电荷降低，最好为+2至-2。上述氨基酸序列的改变(包括N-末端收缩或延伸或缺失)可以根据需要相互结合来加以利用。因此，本专利技术的抑肽酶变异体包括含有上述特征组合、并在生理pH下净正电荷降低的所有化合物。令人惊讶的是，两个或三个上述特征的组合似乎不仅使得我们获得各个特征的表达，而且在某些情况下甚至增强各个特征的表达。此外，也可能产生涉及例如免疫学性质、药物动力学性质和表面结合性质的明显新的物质性质。这些新变异体表现出与多克隆人抗血清和多克隆兔抗血清(使用抑肽酶所产生)的反应减小。我们还发现，与抑肽酶相比，新变异体显著地降低了其免疫原行为，即它们诱导的免疫反应较弱。还有迹象表明，本专利技术的变异体与抑肽酶相比，诱导血细胞释放的组胺数量降低。此外，与抑肽酶相比，新变异体还表现出明显较少肾脏蓄积量。与该分子的早期变异体相比，尽管在该分子中存在大量变化，其酶动力学抑制常数(Ki值)都令人惊讶地提高了。因此，本专利技术涉及在pH7下净电荷为+3至-3、具有氨基酸Arg 15或Arg 15-Ala 17的抑肽酶变异体。优选变异体的净电荷为+2至-2，特别优选为+1至-1。这些抑肽酶变异体适用于血浆血管舒缓素、组织血管舒缓素和纤维蛋白溶酶的抑制。另外，这些抑肽酶变异体具有修饰的N-末端序列。因此，本专利技术的目的是提供具有N-末端延伸或收缩或具有缺失的氨基酸的抑肽酶变异体。推荐的抑肽酶变异体是DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶、DesPro2-Ser10-Arg15-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶、DesPro2-Ser10-Arg15-Ser17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶、DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-抑肽酶和DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Asn41-Glu53-抑肽酶。这些抑肽酶变异体在第2位也携带氨基酸脯氨酸。本专利技术也涉及包含一个或多个这些抑肽酶变异体的药物。描述的新蛋白酶抑制剂适于治疗多种疾病，在这些疾病中(也由于相对复杂的手术方法，诸如在心脏外科或在移植术中的异常关节成形的关节置换中的方法等)，由于血液广泛的或增强的外源表面接触，使血浆中酶系统的活性发生而造成。抑制剂能降低那些具有高度出血危险的手术中血液的损失(例如心脏手术、骨外科和关节外科)。它们适于治疗休克、多处创伤和颅脑创伤、败血症、散播性血管内凝血(DIC)、多器官衰竭、涉及血管舒缓素系统的炎症(诸如风湿性关节炎和哮喘等)。通过抑制血纤维蛋白溶酶，阻止恶性肿瘤的生长的转移。由于抑制舒缓激肽的合成，它们也适用于疼痛和水肿的治疗。它们也适用于透析疗法和预防人造器官炎症、血凝固和出血风险的增加。本专利技术抑肽酶变异体的制备为了制备本专利技术抑肽酶变异体，最好使用基因工程方法。为此，使用常规分子生物学方法，将在各种情况下考虑用于抑肽酶变异体合成的基因工程信息引入适当的表达微生物体内。重组微生物进行发酵；通过选择适宜的条件，表达异源遗传信息。随后从培养肉汤中获得表达的抑肽酶变异体。用于生产本专利技术抑肽酶变异体的适宜的宿主微生物可以是细菌、酵母菌或真菌。表达可以在细胞内进行，或用适当的分泌系统在细胞外进行。抑肽酶变异体可以正确地加工或融合为多肽或蛋白质。专利申请EP 683229、WO89/02463、WO90/10075以及上述各种其它专利申请中描述了用于表达抑肽酶变异体的适宜系统。实施本专利技术的方法酶所用的酶(限制性内切酶、来自牛肠的碱性磷酸酶、T4多核苷酸激酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
ｐＨ７时净电荷为＋３至－３、在结合区内具有氨基酸Ａｒｇ１５或Ａｒｇ１５－Ａｌａ１７的抑肽酶变异体。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：W施罗伊德尔，S比约恩，K诺里斯，V迪尼斯，L诺尔斯科夫劳里特森，ND克里斯滕森，
申请(专利权)人：拜尔公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]