蛇毒酶神经生长因子制造技术

本发明专利技术涉及的是用蛇毒制备神经生长因子的工艺方法，在大量实验基础上，优选眼镜蛇毒，在１０℃以下条件下操作，经ＣＭ－ＳｅｐｎａｄｅｘＣ５０、ＣＭ－ＳｐｈａｔｏｓｅＦＦ、ＳｅｐｎｄｅｘＧ７５三步层析，制成半成品，加入稳定剂白蛋白和冻干制品的赋形剂右旋糖苷，过滤分装，冻干制得。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是用蛇毒制备神经生长因子的工艺方法。神经生长因子是化学名称，中文名神经活素(神经生因子)，英文名NERVE GROWTH FACTOR，简称NGF。神经生长因子(NGF)是最早发现的细胞生长调节因子，也是神经系统最重要的生物活性分子之一。从发现NGF至今已40年，它的发现和研究开拓了神经科学一个崭新的领域，促进了发展生物学和细胞生物学的研究和进展。为此，1986年诺贝尔评委会高度评价了这一工作的理论意义和应用价值，并将该年度诺贝尔医学生物学奖授予在NGF研究中做出杰出贡献的两位科学家Levi-Montalcini(意大利)和Cohen(美国)。根据文献报告NGF已从许多生物材料中分离纯化获得，这些材料包括蛇毒、小鼠颌下腺、人足月胎盘、豚鼠前列腺和牛精囊等，但含量最丰富的仍是雄性小鼠颌下腺和多种蛇毒。由于NGF在神经系统的发育和损伤起着重要的作用，因此国外一些制药公司都投入大量的人力和物力对NGF进行开发和研究。目前国外研究与开发处于领先的是Grentech公司，主要用NGF治疗外周神经损伤和一些神经变形性疾病，目前已进入二期临床，但尚未形成商品。而国内目前尚未有得到批准的NGF商品。国外生产的同类产品售价过于昂贵。据知美国Sigma公司生产的NGF仅0.01mg，即高达118美元，实非一般国人所能承受。考虑我国蛇毒资源较为丰富，价格低廉，若从中分离提纯NGF将有很大的药用价值和经济价值。神经再生的研究一直是国内学者长期致力研究的课题。大量的实验研究结果表明神经生长因子具有促进交感神经元、感觉神经元和前脑胆碱能神经元等神经元发育和分化，并维持它们的正常功能，促进它们损伤后的修复。所以尽快地使神经生长因子应用于临床，解除患者的痛苦，乃是当前摆在我们面前一个重要的课题。因此我们首先对神经生长因子纯化工艺进行了研究，目前我们已经建立一个中式规模生产神经生长因子的工艺，为我们深入研究神经生长因子的药理学和临床应用打下了基础。本专利技术的目的，就是提供一种用蛇毒制备神经生长因子的工艺方法。本专利技术的目的是采取以下技术方案实现的在大量实验研究基础上，确定了神经生长因子的最佳制造工艺路线。从产率、比活性等技术参数优选眼镜蛇毒作为分离纯化神经生长因子的基料，经三步层析，提纯单一组份的神经生长因子。采用上述的技术方案制备出来的神经生长因子，经临床前药理的动物试验表明，神经生长因子是一种对中枢神经系统和外周神经系统生长、发育和生存所必须的神经细胞生长活性物质经研究证实具有下述作用(1)促进神经元的发育和分化。(2)营养成熟的神经元，维持其存活与功能。(3)具有保护损伤的效应神经元，在此基础上促进神经纤维再生修复。(4)神经生长因子是受损伤或发生的运动神经元诱向因子。制备工艺所有操作均在10℃以下完成。①CM-Sephadex C50层析取眼镜蛇毒10g，溶于0.01M酸钠缓冲液、(FH5.8)100ml中，溶解后，离心10000转，10分钟，取上清，对上述缓冲液5000ml透析，换3次缓冲液，然后样品上样于用0.01M乙酸盐缓冲液平衡好的层析柱(5.5×100cm)中，用0-0.7MNaCL线性梯度洗脱，收集具有神经生长因子活性的蛋白峰，浓缩冻干。②CM-SpharoseFF层析将上述浓缩的样品，溶于20ml 0.01M乙酸钠缓冲液(FH5.8)中，上样于用0.01M乙酸钠缓冲液(PH5.8)平衡好的层析柱(2.6×50cm)中，用0-1MNaCL线性梯度洗脱，收集具有神经生长因子活性的蛋白峰，浓缩冻干。③SephdexG75层析将上述CM-SpharoseFF层析下的样品，溶解在10ml 0.01M乙酸钠缓冲液，PH5.8内含0.15MNaCL中，离心10000转，取上清，上sephdexG75(2.6×100cm)柱(已用0.01M乙酸钠缓冲液，PH5.8，内含0.15M/L平衡好)，收集含有NGF活性的对称峰，经电泳及高效液相色谱证明为单一峰后，透析除盐，冻干即得半成品(约3mg)。④制剂处方原料神经生长因子半成品，按质量标准的测定半成品的活性，每支规格1000单位，按135％-145％投料。加入1％右旋糖苷(分子量1万)，及每支药中含有1.5mg人血白蛋白，过滤分装，冻干制得。适应症用于治疗各种原因引起的周围神经损伤；①牵拉伤、切割伤、挫伤等所致周围神经损伤；②代谢性疾病糖尿病、尿毒症等引起周围神经病变；③椎间盘突出，颈椎病变引起神经病变；④抗肿瘤药物紫杉醇等引起的神经病变，感染性周围神经元等。用法和用量及给药途径①每次1000-2000单位，肌肉注射，每日一次，20天为一个疗程。②四肢损伤手术中，可在术局部喷洒给药或损伤神经处局部注射，每次1-2支。注意事项①本品为蛋白类制剂，过敏体质慎用。若出现过敏反应，按过敏反应处理。②溶解药品时需反复振荡才能溶解。有效期及贮藏条件10℃以下保存，暂定2年。权利要求1.蛇毒酶神经生长因子，其特征在于他有一个科学的制备工艺所有操作均在10℃以下完成。①CM-Sephadex C50层析取眼镜蛇毒10g，溶于0.01M乙酸钠缓冲液、(FH5.8)100ml中，溶解后，离心10000转，10分钟，取上清，对上述缓冲液5000ml透析，换3次缓冲液，然后样品上样于用0.01M乙酸盐缓冲液平衡好的层析柱(5.5×100cm)中，用0-0.7MNaCL线性梯度洗脱，收集具有神经生长因子活性的蛋白峰，浓缩冻干。②CM-SpharoseFF层析将上述浓缩的样品；溶于20ml 0.01M乙酸钠缓冲液(FH5.8)中，上样于用0.01M乙酸钠缓冲液(PH5.8)平衡好的层析柱(2.6×50cm)中，用0-1MNaCL线性梯度洗脱，收集具有神经生长因子活性的蛋白峰，浓缩冻干。③SephdexG75层析将上述CM-SpharoseFF层析下的样品，溶解在10ml 0.01M乙酸钠缓冲液，PH5.8内含0.15MNaCL中，离心10000转，取上清，上sephdexG75(2.6×100cm)柱(已用0.01M乙酸钠缓冲液，PH5.8，内含0.15M/L平衡好)，收集含有NGF活性的对称峰，经电泳及高效液相色谱证明为单一峰后，透析除盐，冻干即得半成品(约3mg)。④制剂处方原料神经生长因子半成品，按质量标准的测定半成品的活性，每支规格1000单位，按135％-145％投料。加入1％右旋糖苷(分子量1万)，及每支药中含有1.5mg人血白蛋白，过滤分装，冻干制得。全文摘要本专利技术涉及的是用蛇毒制备神经生长因子的工艺方法,在大量实验基础上,优选眼镜蛇毒,在10℃以下条件下操作,经CM－SepnadexC50、CM－SphatoseFF、SepndexG75三步层析,制成半成品,加入稳定剂白蛋白和冻干制品的赋形剂右旋糖苷,过滤分装,冻干制得。文档编号C07K14/435GK1285357SQ99111530公开日2001年2月28日 申请日期1999年8月20日 优先权日1999年8月20日专利技术者潘 清, 郝文学 申请人:郝文学本文档来自技高网...

【技术保护点】
蛇毒酶神经生长因子，其特征在于：他有一个科学的制备工艺：所有操作均在１０℃以下完成。①ＣＭ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ５０层析取眼镜蛇毒１０ｇ，溶于０．０１Ｍ乙酸钠缓冲液、（ＦＨ５．８）１００ｍｌ中，溶解后，离心１００００转，１０分钟 ，取上清，对上述缓冲液５０００ｍｌ透析，换３次缓冲液，然后样品上样于用０．０１Ｍ乙酸盐缓冲液平衡好的层析柱（５．５×１００ｃｍ）中，用０－０．７ＭＮａＣＬ线性梯度洗脱，收集具有神经生长因子活性的蛋白峰，浓缩冻干。②ＣＭ－Ｓｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ层析将上述浓缩的样品；溶于２０ｍｌ０．０１Ｍ乙酸钠缓冲液（ＦＨ５．８）中，上样于用０．０１Ｍ乙酸钠缓冲液（ＰＨ５．８）平衡好的层析柱（２．６×５０ｃｍ）中，用０－１ＭＮａＣＬ线性梯度洗脱，收集具有神经生长因子活性的蛋白峰，浓缩冻干。 ③ＳｅｐｈｄｅｘＧ７５层析将上述ＣＭ－ＳｐｈａｒｏｓｅＦＦ层析下的样品，溶解在１０ｍｌ０．０１Ｍ乙酸钠缓冲液，ＰＨ５．８内含０．１５ＭＮａＣＬ中，离心１００００转，取上清，上ｓｅｐｈｄｅｘＧ７５（２．６×１００ｃｍ）柱（已用０．０１ Ｍ乙酸钠缓冲液，ＰＨ５．８，内含０．１５Ｍ／Ｌ平衡好），收集含有ＮＧＦ活性的对称峰，经电泳及高效液相色谱证明为单一峰后，透析除盐，冻干即得半成品（约３ｍｇ）。④制剂处方：原料：神经生长因子半成品，按质量标准的测定半成品的活性，每支规 格１０００单位，按１３５％－１４５％投料。加入１％右旋糖苷（分子量１万），及每支药中含有１．５ｍｇ人血白蛋白，过滤分装，冻干制得。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：潘清，郝文学，
申请(专利权)人：郝文学，
类型：发明
国别省市：21[中国|辽宁]