一种用于治疗、预防及诊断ＳＡＲＳ－ＣｏＶ的抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ免疫球蛋白抗体，其特征在于该抗体是的制备方法包括如下步骤： １）灭活纯化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ加入不完全福氏佐剂乳化制备免疫原，采用皮下、肌肉、腹股沟淋巴结多点免疫经检疫符合生物制品要求的马匹，免疫四次、间隔１０天免疫一次，试血测抗体效价对流电泳１∶１２８、间接酶联免疫１∶１２８００，测抗体中和效价细胞病变法１∶１２８００、空斑减数法１∶１２８００，并不同ＳＡＲＳ－ＣｏＶ标准株免疫马产生的中和抗体均与其它ＳＡＲＳ－ＣｏＶ毒株呈现一致的中和抗体活性； ２）采集马抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ血浆，用无热源２倍蒸馏水稀释加入２１％饱和度硫酸铵混匀、离心弃沉淀纤维蛋白和白蛋白，上清再加入９％饱和度硫酸铵混匀离心要沉淀免疫球蛋白Ｇ，用无热源蒸馏水恢复原体积再用３０％饱和度硫酸铵混匀、离心要沉淀ＩｇＧ，先加入一定量的无热源蒸馏水、后加入无热源０．９％氯化钠盐水用６万超滤器超滤除盐、浓缩和去杂蛋白，超滤液为纯化马抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＩｇＧ； ３）纯化的马抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ＩｇＧ用盐酸调ＰＨ至３．２后胃蛋白酶切割，再用氢氧化钠调ＰＨ至７．４，加热５８℃、３０ｍｉｎ，用帆布过滤去Ｆｃ段，滤液为初步纯化马抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ免疫球蛋白Ｆ（ａｂ′）↓［２］抗体； ４）初步纯化的马抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ免疫球蛋白Ｆ（ａｂ′）↓［２］抗体过苯基蔬水层析，用２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０磷酸缓冲液、１ｍｏｌ／Ｌ硫酸铵上柱，２０ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０磷酸缓冲液收集Ｆ（ａｂ′）↓［２］抗体流出液，再用６万超滤器超滤除盐、浓缩，为纯化马抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ免疫球蛋白Ｆ（ａｂ′）↓［２］抗体。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于治疗、预防及诊断SARS-CoV的抗SARS-CoV免疫球蛋白抗体，属于生物制药领域。
技术介绍
世界卫生组织在今年3月12日发出关于非典型肺炎(atypicalpneumonia)的全球性警告之后，随后命名为严重急性呼吸综合征(SevereAcute Respiratory Syndrome，SARS)。在WHO的高度重视、协调和组织下，引起SARS的病原体很快被确认为一种新的或变异的冠状病毒，并相应命名为SARS-CoV。自SARS爆发后很快在全球传播，现已蔓延到世界30多个国家和地区，严重地影响人们的健康和生命，成为21世纪初最危害人类的头号大敌。马抗血清(又叫马抗免疫球蛋白)自古以来是用于重要病原体感染的一种有效的应急治疗措施，至今至少有7种抗血清在临床广泛应用，发挥重要的治疗和预防传染病的作用。马抗血清发展经历了传统的整个抗体分子，发展到今天有效去掉能引起毒副作用的Fc段抗体分子和其它血浆杂蛋白分子，获得具有与病原体抗原特异结合的高纯度F(ab′)2治疗抗体，达到消灭病原体的效果。基于香港、新加坡和我国大陆报道针对SARS恢复期病人的血清具有治疗SARS的作用，但SARS恢复期病人血清的广泛应用存在一定的问题，并且人们对SARS-CoV的认识还很浮浅，特别是在安全性等方面存在一定的问题，制约其应用和发展。因此，研制有治疗与预防SARS的马抗SARS-CoV免疫球蛋白，是非常有价值的治疗性和预防性抗体药物。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于公开一种新型的用于治疗、预防及诊断SARS-CoV的抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体；本专利技术的另一个目的在于公开制备马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体的方法。一种用于治疗、预防及诊断SARS-CoV的抗SARS-CoV免疫球蛋白抗体，是马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体。本专利技术马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体的制备包括以下步骤1)灭活纯化SARS-CoV加入不完全福氏佐剂乳化制备免疫原，采用皮下、肌肉、腹股沟淋巴结多点免疫经检疫符合生物制品要求的马匹，免疫四次、间隔10天免疫一次，试血测抗体效价对流电泳1∶128、间接酶联免疫1∶12800，测抗体中和效价细胞病变法1∶12800、空斑减数法1∶12800，并不同SARS-CoV标准株免疫马产生的中和抗体均与其它SARS-CoV毒株呈现一致的中和抗体活性；2)采集马抗SARS-CoV血浆，用无热源2倍蒸馏水稀释加入21％饱和度硫酸铵混匀、离心弃沉淀纤维蛋白和白蛋白，上清再加入9％饱和度硫酸铵混匀离心要沉淀免疫球蛋白G(IgG)，用无热源蒸馏水恢复原体积再用30％饱和度硫酸铵混匀、离心要沉淀IgG，先加入一定量的无热源蒸馏水、后加入无热源0.9％氯化钠盐水用6万超滤器超滤除盐、浓缩和去杂蛋白，超滤液为纯化马抗SARS-CoV IgG；3)纯化的马抗SARS-CoV IgG用盐酸调PH至3.2后胃蛋白酶切割，再用氢氧化钠调PH至7.4，加热58℃、30min，用帆布过滤去Fc段，滤液为初步纯化马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体；4)初步纯化的马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体过苯基蔬水层析(Phenyl Sepharose 6 Fast Flow)，用200mmol/L pH7.0磷酸缓冲液、1mol/L硫酸铵上柱，20mmol/L pH7.0磷酸缓冲液收集F(ab′)2抗体流出液，再用6万超滤器超滤除盐、浓缩，为纯化马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体。本专利技术制备的纯化的马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体可制备成马抗SARS-CoV免疫球蛋白注射剂型和黏膜喷雾剂型成品。本专利技术所用纯化的灭活SARS-CoV可以通过如下步骤制得1)绿猴肾细胞(Vero细胞)的复苏、培养，取细胞种子库冻存Vero细胞株，用DMEM培养基并加入10％小牛血清培养，提供培养SARS-CoV的Vero细胞；2)SARS冠状病毒(SARS-CoV)滴定，对培养的Vero细胞加入经鉴定冻存的SARS-CoV，扩增培养SARS-CoV，采用组织培养半数感染量(TCID50)测定SARS-CoV的毒力(106-108)，对滴定的SARS-CoV分装冻存；3)用长满单层的Vero细胞加入滴定的SARS-CoV，用无血清DMEM培养SARS-CoV，生产SARS-CoV；4)Vero细胞完全病变后收集SARS-CoV培养液，反复冻融三次(冰冻-37℃)或不冻融，收集SARS-CoV细胞培养液；5)向SARS-CoV培养液加入1/2000-1/8000的β-丙内酯，4℃过夜、37℃2h灭活SARS-CoV，取灭活的SARS-CoV培养液在Vero细胞上连传三代，检测SARS-CoV灭活效果；6)灭活的SARS-CoV培养液，4℃、离心12000rpm/min 30min，弃沉淀杂蛋白，上清为SARS-CoV液；7)用分子量30万超滤柱超滤SARS-CoV液，浓缩和去杂蛋白，滤液为粗制灭活SARS-CoV；8)对粗制灭活SARS-CoV上Sepharose 4 Fast Flow分子筛柱，开始缓冲液是0.1MPBS PH7.0缓冲液，用100mM PBS PH7.0洗脱，收集SARS-CoV，合并浓缩收集初步纯化SARS-CoV；9)对初步纯化的SARS-CoV液上DE52阴离子柱层析，用100mM PB，PH7.2液平衡并将病毒吸附在柱上、用100mM PB，PH7.2，0.35M NaCl洗脱，收集SARS-CoV峰，合并浓缩收集纯化SARS-CoV；10)对超滤浓缩后SARS-CoV液的效果分析，用双抗体夹心法测得抗原回收率平均为55％、用改良Lowry法测得杂蛋白去除率平均为92％；11)对凝胶过滤纯化SARS-CoV的效果分析，用双抗体夹心法测得抗原回收率平均为85％、采用改良Lowry法测得杂蛋白去除率平均为94.5％、用电镜观察病毒颗粒完整、用斑点杂交测定Vero细胞残留DNA含量小于10.0ng/ml、用血凝抑制实验测定病毒残余牛血清含量小于12.5ng/ml；12)对离子交换纯化SARS-CoV的效果分析，用双抗体夹心法测得蛋白抗原由纯化前的9.4ng/U，降低到0.8ng/U，HPLC显示病毒纯度为97％；采用改良Lowry法测得杂蛋白去除率平均为98.5％；用电镜观察病毒颗粒完整、用斑点杂交测定Vero细胞残留DNA含量小于1.0ng/ml；SDS-PAGE显示有SARS-CoV的S、N、M、主要蛋白条带，并与恢复期SARS病人的血清发生反应，纯化灭活SARS-CoV分装放-70℃保存。本专利技术利用分离的SARS-CoV经培养、灭活、纯化后免疫健康马匹，产生高效价中和SARS-CoV的抗血清，去除能引起副作用的Fc片段，制备马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体，能特异消灭SARS-CoV，对非典型肺炎的治疗和预防有很好的效果；纯化马抗SARS-CoV免疫球蛋白抗体对SARS-CoV具有很好的特异性及灵敏性。以下实验例进步说明本专利技术。实验例1精制马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(a本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王希良，杜新安，石辛甫，张松乐，刘建源，李岩，赵光宇，田光，周华，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，
类型：发明
国别省市：
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