一种胡萝卜子转脂多肽制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种胡萝卜子转脂多肽制备方法和应用，采用提取、分离、纯化方法从胡萝卜子中制备转脂多肽，通过该方法获得的胡萝卜子转脂多肽经液相色谱分离得到分子量为９６２４的抗棉花枯萎病的转脂多肽；经Ｅｄｍａｎ降解法确定其部分Ｎ－端氨基酸序列为：Ｎ－异亮氨酸－丝氨酸－半胱氨酸－甘氨酸－谷氨酰胺－缬氨酸－苏氨酸－丝氨酸－丝氨酸－异亮氨酸；该序列与烟草、大米、玉米转脂蛋白的氨基酸序列具有高度一直性；并具有很好的水溶性、热稳定性和具有很强的抗棉花枯萎病活性。可作为制备药品、保健食品、食品、食品添加剂、抗氧化剂或药品增效剂的应用。同时还可作为制备植物转基因抗病原体的应用，是转基因研究培育增强抗病植物的最佳物质基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种植物抗菌多肽类化合物的提取、分离、纯化方法， 尤其是胡萝卜子转脂多肽制备方法，并通过该方法获得的胡萝卜子转 脂多肽作为药品、保健食品、食品、抗氧化剂、药品增效剂，药品配 方等及植物转基因抗病原体研究和应用。
技术介绍
抗菌肽是一类具有广谱高效杀菌活性的碱性多肽类物质，含有10 100个氨基酸残基，成熟的抗菌肽来源于前体蛋白的水解，大多数抗菌多肽由于富含碱性氨基酸而带净正电荷。由于最初被发现的是其抗细菌功能，因而被命名为抗菌肽(antibacterial p印tides， AMPs)。根据植物多肽抗生素的氨基酸序列及二级结构，可将植物多 肽抗生素分为9类，包括硫素(thionins)、植物防御素(plant defensins)、转月旨蛋白(lipid transfer proteins, LTPs)、橡胶素 (heveins)、打结素(knottins)、凤仙花素(lb-AMPs)和新近发现 的荠菜素(sh印herdins)、蜕皮素(snakins)、环肽(cyclotides) 等。它们共同特点是具有广泛的抗真菌、细菌、抗HIV、抑制a淀粉 酶活性、抗氧化和紧縮子宫等作用。抗菌多肽作为抵御外界微生物的 第一道防线，有着强大而广泛的抗菌功能，是动物尤其是昆虫非特异 性免疫系统的重要组成部分。随着研究的不断深人，人们发现某些抗 菌肽还对部分真菌、原虫、病毒甚至癌细胞具有明显的杀伤作用，是 一类具有重要潜在应用价值的活性物质。尽管抗菌多肽作为古老的天 然抗微生物的物质，担负了极其重要的免疫功能，可是受到的关注也 比较少。目前，抗生素滥用导致的病原菌产生耐受力是困扰许多国家的一 个难题。寻找合适的活性物质来替代抗生素是解决这一 问题最有效的 途径。抗菌肽具有水溶性好、热稳定、广谱抗菌及不易引起病原产生 耐药性等优点，是理想的抗生素替代品。植物，特别是植物种子在生 长过程中常会受到微生物侵袭，抗菌肽是直接参与^制微生物繁衍、 生长、繁殖的重要化学防御工具之一，因此在植物中寻找具有活性的 抗菌肽具有重要的理论及应用价值。转脂蛋白(LTPs: Lipid transfer protein):是具有在两个细胞膜之 间转移磷脂功能的多肽。它是由60 90个氨基酸组成的小分子量的 蛋白质，它的结构是四个二硫的桥键结合中间形成水性隧道成结构。胡萝卜的入药部位是全草，种子和根。胡萝卜富含3胡萝卜素， P胡萝卜素是一种抗氧化剂，可防止细胞变性，放慢老龄化的进程。 胡萝卜种子是驱风剂，兴奋剂，对胀气，多风绞痛，呃逆，痢疾， 慢性咳嗽有一定疗效，它还具有抗细菌和抗真菌特性。胡萝卜子油有 助于控制发痒的头皮，并提供必需的营养物质，促进头发的生长。大量文献检索所知，目前国内外没有任何有关芹菜子、莳萝子、 胡萝卜子等药食用植物资源活性多肽类化合物的研究报道。在国内植 物多肽类化合物的研究尚处于初始阶段，研究范围小，研究主要集中 在药理、基因表达研究和综述等方面，对于多肽类化合物的化学研究 文献很有限，而且使用的方法中植物多肽类化合物回收低，不适用于 大规模制备，这很大程度上限制了多肽类活性化合物的应用和工业化 生产。
技术实现思路
本专利技术目的在于，提供一种胡萝卜子转脂多肽制备方法，采用提 取、分离、纯化方法从胡萝卜子中制备转脂多肽，通过该方法获得的 胡萝卜子转脂多肽通过液相色谱分离得到分子量为9624的抗棉花枯 萎病的转脂多肽；通过Edman降解法确定其部分N-端氨基酸序列为N-异亮氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺-缬氨酸-苏氨酸-丝氨酸-丝氨酸-异亮氨酸，该序列与烟草、大米、玉米转脂蛋白的氨基酸序列具有高度一直性；并具有很好的水溶性、热稳定性和具有很强的抗棉花枯萎病活性。可作为制备药品、保健食品、食品、食品添加 剂或药品增效剂的应用。同时还可作为制备植物转基因抗病原体的应 用，是转基因研究培育增强抗病植物的最佳物质基础。为利用新疆伞 形科属维药多肽类化合物的新药开发研究提供可行实验方法。本专利技术所述的一种胡萝卜子转脂多肽制备方法，该方法采用提 取、分离、纯化方法从胡萝卜子中制备转脂多肽，具体操作按下列步骤进行；a、 将胡萝卜子用液氮冰冻研磨进行细胞破碎；b、 利用pH 6. 8-8. 5磷酸钠缓冲溶液提取胡萝卜子总蛋白、脱盐、 剃度季氨盐沉淀、离心得到胡萝卜子总多肽，提取温度为0-15°C， 时间30 min-5 h;c、 将胡萝卜子总多肽进行热处理，温度50—IO(TC的水浴中处 理5—50分钟，得到热稳定性多总肽； 'd、 胡萝卜子总多肽应用阴离子交换层析方法分离总阴离子多肽；e、 胡萝卜子总阴离子应用阳离子交换柱得到总阳离子多肽；f、 胡萝卜子总阳离子多肽脱盐，冷冻干燥得到总多肽粉。 步骤b胡萝卜子总蛋白质利用分子量限制在1000 Da透析袋进行脱盐。步骤b利用低温离心机离心除去沉淀，专速为200-12000prm ， 4 。C，离心l-60分钟。步骤d利用纤维素二乙基氨乙基-SN-23阴离子交换柱层析，在 pH 7. 1-9. 0缓冲溶液分离阴离子性多肽。步骤e利用羧甲基纤维素TSK-650M阳离子交换柱层析，在pH 4.0-6.8缓冲溶液得到胡罗卜子总阳离子多肽。通过液相色谱分离得到分子量为9624的抗棉花枯萎病的转脂多 肽。 .通过Edman降解法确定其部分N-端氨基酸序列为N-异亮氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺-缬氨酸-苏氨酸-丝氨酸-丝氨酸 -异亮氨酸。所述的制备方法获得的胡萝卜子转脂多肽作为制备药品、保健食 品、食品、抗氧化剂或药品增效剂的用途。所述的制备方法获得的胡萝卜子转脂多肽作为制备植物转基因 抗病原体的用途。本专利技术所述的方法实验步聚为1. 取胡萝卜子粉用液氮冰冻破碎胡萝卜子细胞。2. 液氮处理过的胡萝卜子粉在缓冲溶液中在4。C搅拌提取2h， 并冷冻离心机离心取上层溶液，冷冻干燥得到总蛋白质；3. 胡萝卜子总蛋白质在85。C水浴上热处理15分钟，并冷冻离 心去热变性高分子量蛋白质，并离心取上清液；依次相对饱和度为1 30%的硫酸氨沉淀蛋白质提取溶液，并4 'C下放置12小时，梯度沉淀3次，取上清液；4. 将取上清液低温离心机离心，取上清液用饱和度为30 80% 的硫酸氨沉淀，并4'C下放置12小时梯度沉淀3次，低温离心机离 心得到胡罗卜子总多肽，并低温干燥机干燥得到粉末胡罗卜子总多 肽；5. 取胡萝卜子豆总多肽加蒸馏水至完全溶解，并利用分子量限 制在IOOO Da透析袋用pH 8.9的NH4Ac缓冲液透析过夜；6. 将透析袋过pH 8.9的MUc缓冲液平衡5次的纤维素二乙 基氨乙基-SN-23阴离子交换树脂柱，并收集与阴离子柱子未结合的 馏分收集、合并；7. 阴离子交换柱子未结合的溶液中在搅拌下滴加醋酸(HAc)，调节调溶液pH6.0，并过pH6.0的NH4Ac缓冲液平衡5次的阳离子 羧甲基纤维素TSK-650M柱子，被填料吸附的阳离子多肽,利用0-1M剃 度浓度的NaCl在pH 6. 0的NH4Ac缓冲液洗脱，并收集280nm有自外 吸收的洗脱液合并，用交联葡聚糖-G-15层析柱子脱盐，得到阳性胡 罗卜子总多肽成分，冷冻干燥得到粉末总多肽.8.总多肽利用碳十八柱子反本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胡萝卜子转脂多肽的制备方法，其特征在于采用提取、分离、纯化从胡萝卜子中制备转脂多肽，具体操作按下列步骤进行；　　　　ａ、将胡萝卜子用液氮冰冻研磨进行细胞破碎；　　　　ｂ、利用ｐＨ６．８－８．５磷酸钠缓冲溶液提取胡萝卜子总蛋白、离心，剃度季氨盐沉淀、离心，脱盐、离心得到胡萝卜子总多肽，提取温度为０－１５℃，时间３０ｍｉｎ－５ｈ；　　　　ｃ、将胡萝卜子总多肽进行热处理，温度５０－１００℃的水浴中处理５－５０分钟，离心分离热不稳定的多肽，得到热稳定性总多肽；　　　　ｄ、胡萝卜子总多肽应用阴离子交换色谱方法分离总阴离子多肽；　　　　ｅ、胡萝卜子总阴离子应用阳离子交换色谱方法得到总阳离子多肽；　　　　ｆ、胡萝卜子总阳离子多肽脱盐，冷冻干燥得到总多肽粉。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：阿不力米提伊力，阿吉艾克拜尔艾萨，吕俏莹，
申请(专利权)人：中国科学院新疆理化技术研究所，
类型：发明
国别省市：65[中国|新疆]