一种C端特异的人Eme1多肽及其抗体制备方法技术

本发明专利技术公开了一种Ｃ端特异的人Ｅｍｅ１多肽及其抗体的制备方法，属于生物医学技术领域。Ｃ端特异的人Ｅｍｅ１多肽的氨基酸序列为：ＶＲＲＧＥＧＶＴＳＴＳＲＲＩＧ。抗人Ｅｍｅ１多肽抗体按以下方法制备：（１）人Ｅｍｅ１抗原表位的分析；（２）人Ｅｍｅ１Ｃ端多肽的合成；（３）合成多肽与载体蛋白交联；（４）制备兔抗人Ｅｍｅ１多肽抗体；（５）收集、分离得到含有抗体的血清，纯化抗体，即得到抗人Ｅｍｅ１多肽抗体。本发明专利技术制备的Ｃ端特异的抗人Ｅｍｅ１合成多肽抗体效价高、亲和力强、特异性好，可与天然人Ｅｍｅ１发生特异性结合；制备成本低；纯化后的抗体可完全用于免疫印迹和酶联免疫吸附实验，以及建立体外免疫分析方法。该抗体为Ｅｍｅ１在ＤＮＡ损伤和基因组稳定性方面的生物学作用研究提供了有用的工具。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及以抗体为特征的体外试验用的生物制品，具体是一种C端 特异的人Eme1多肽及其抗体制备方法，属于生物医学

技术介绍
Eme1 (essential meiotic endonudease 1 homolog 1揮白与Mus81复合 在一起即构成了能切割有分支DNA结构的外切核酸酶。研究表明，敲除了 Eme1基因的胚胎干细胞对丝裂霉素C等DNA交联剂高度敏感，对离子辐射、 UV辐射以及羟基脲处理敏感性稍弱。此外，研究结果还显示Eme1在哺乳 动物基因组完整性的维持和DNA修复过程中发挥了非常关键的作用，其缺陷 可导致自发的基因组不稳定性。
技术实现思路
本专利技术是为解决通过免疫实验特异性检测Eme1的表达与天然存在， 并建立相应体外免疫分析所需基本生物制品的问题，而提供的一种能特异 性针对Eme1的C端合成多肽抗体及其制备方法。本专利技术还可同时解决目前使用的类似抗体价格高，亲和力低，抗体结合蛋白的位置不特异且抗原性较差等问题。本专利技术所述的抗Eme1合成多肽抗体，按照以下步骤制备:抗原表位分析与拮抗位置确定利用多种表位预测软件，如DNAstar， OMIGA， UWGCG等进行综合分析，主要考量指标包括亲水性结构、抗 原指数、表面可及性等，再结合我们已有实际制备抗体的验证经验，最终 确定第532到第546位为该抗体的靶标，其氨基酸序列为 VRRGEGVTSTSRRIG。多肽的合成靶标多肽采用全自动多通道多肽合成仪合成，柱层析纯化，然后通过HPLC，用每分钟1。/。的标准乙晴梯度来检测纯度。多肽与载体蛋白交联由于本合成多肽分子量太小，在动物体内不能 诱导产生免疫反应，因此将多肽与载体蛋白交联后才能进行免疫，选择钥 孔嘁血蓝素进行交联，能显著增加抗原的大小和免疫原性，从而制备出人 工免疫原。免疫动物所述的制备方法，其抗原肽-交联载体蛋白做为免疫原，免 疫家兔制备抗体。选取适龄免疫用新西兰兔，经过适应性词养后进行多点 注射免疫。反复加强免疫，至取血测抗体效价达到标准时停止免疫。抗体纯化达到要求的免疫动物放血，标准方法收集抗血清，依次使 用辛酸-硫酸铵方法和亲和层析过柱纯化方法，进行抗血清纯化，通过SDS-PAGE和HPLC验证纯度，得到目标抗体。本专利技术制备的高质量多肽抗体效价高、亲和力强，可与天然Eme1分 子发生特异性结合反应。用多肽制备抗体的成本较常规的重组抗原制备抗体方法低，抗体特异性好，经亲和层析纯化后可以用于各种酶免检测和WB试验要求，可用于建立体外免疫分析。该合成肽抗体的制备，为Eme1分子的研究及其相关疾病的研究(如诊断策略的制定，流行病学调査、预 防和控制)提供了一个重要的工具，以及在生物医学研究中对相应耙蛋白 的特性、含量测定、分布情况的分析和蛋白的确证等方面都具有重要作用。附图说明图1是液相色谱鉴定合成多肽纯度结果图。 图2是质谱鉴定合成多肽分子量结果图。图3是通过间接ELISA方法鉴定纯化抗体相对亲和常数结果图。图1表明经过HPLC对合成的多肽进行纯化后，液相色谱鉴定纯度 为94.8%。图2表明多肽分子量理论值为1733，质谱鉴定实测值M+H+为 1734.4。图3中ELISA检测制备的多抗和多肽抗原亲和常数为109-101QL/mol。具体实施方式实施例1: Eme1抗原肽的合成。用DNAstar， OMIGA， UWGCG等蛋白分析软件，对Eme1氨基酸 序列进行亲水性结构(hydrophilicity)、抗原指数(antigenicity)、表面可及性 (surface pmbability)以及同源性(homology)等分析，再结合我们已有实际 制备抗体的验证经验，最终确定第532到第546位为靶标，其氨基酸序 列为VRRGEGVTSTSRRIG。在全自动多肽合成仪上由固定羧基向氨基端 递减合成后获得粗品。经30%乙睛溶解后，进行高压液相色谱(HPLC) 分析，计算主峰面积并收集，经冷冻真空抽干后纯化合成肽，质谱鉴定。实施例2:合成多肽与载体的偶联。载体蛋白选择KLH (Keyhole ljmpethemocyanin)，用双功能试剂 顺丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯(MBS)连接法将KLH与合成肽进行偶联 取KLH5mg (0.11|jmo!，含赖氨酸2.2|jmol)，溶于C).75mL偶联缓冲液 1 (50mmol/L硼酸盐缓冲液，pH8.5) ; 3mg MBS (11|jmo)溶于75|jL 二甲酰胺(DMF)。将MBS溶液分3次加入KLH溶液，旋转混匀，室温 作用30分钟。迅速离心后，'将反应混合物(约0.8mL)加入预先用偶联 缓冲液2(0.1 mol/L磷酸盐，0.15mol/LNaCL， 0.01mol/LNa2EDTA， pH7.0) 平衡的PD-10柱。用偶联缓冲液2洗脱，收集洗脱液(即MBS-KLH溶 液)。溶解1.5mg合成多肽于0.15mL偶联缓冲液2，加入MBS-KLH缓 冲液0.56，室温下旋转混合，作用2小时后置4。C过夜，将反应混合物 (约0.7mL)加入预先用磷酸缓冲液平衡的PD-10柱，磷酸缓冲液洗脱， 收集流出液。将KLH、 MBS-KLH和偶联物进行SDS-KLH和偶联物进行 SDS-PAGE (聚丙烯酰胺凝胶电泳)鉴定偶联效率。实施例3*.抗多肽抗体的制备。取偶联的KLH-多肽500ijg，溶于500 t-2 t)算出抗体相对亲和常数，其中t 、 t指的是Aso时即包被抗原 分别为g/mL和10u g/mL时抗体半饱和时抗体的摩尔浓度， t、 t指的是包被的抗原浓度本实验中即指10 ii g禾卩5 u g， n= t/ t，本实验中n=2。试验效果1. Eme1合成多肽HPLC纯化后，使用液相色谱鉴定纯度为94.8。/。。 多肽分子量理论值为1733，质谱鉴定实测值M+H+为1734.4。2. 多肽与载体的偶联效率SDS-PAGE电泳鉴定偶联效率与样品回 收率大致相符，大于80%。3. 抗体效价多只家兔得到的抗血清效价均在1:100万以上。4. 抗体亲和力相对亲和常数为109-101QL/mol。5. 抗体的应用以上技术指标的实现保证该抗体完全可以应用于蛋 白印迹和各种酶免实验，以及建立相应体外免疫分析试剂。序列表<110>北京意宏安生物科技有限公司<120> —种C端特异的人Eme1多肽及其抗体制备方法 <160>2<210> 1 <211> 570 <212> PRT <213>人<400> 1MALKKSSPSLDSGDSDSEELPTFAFVRRGEGVTSTSRRIGEEKIVW DISDCEASCPPAPELFSPPVPDIAETVTQTQPVRLLSSESEDEEEFIPLAQ RLTCKFLTHKQLSPEDSSSPVKSVLDHQNNEGASCDWKKPFPKIPEVPL HDTPERSAADNKDLILDPCCQLPAYLSTCPGQSSSLAVTKTNSDILPPQK KTKPSQKVQGRGSHGCQQQRQARQKESTLRRQERKNAALVTRMKAQR PEECLKHIIWLDPVL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Ｃ端特异的人Ｅｍｅ１多肽，其特征在于多肽的氨基酸序列为：ＶＲＲＧＥＧＶＴＳＴＳＲＲＩＧ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈光宇，杜宏武，王德仙，陈吾奇，
申请(专利权)人：北京意宏安生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]