本发明专利技术公开了一种Ｃ端特异的人Ｄｂｆ４多肽及其抗体的制备方法，属于以抗体为特征的体外试验用的生物制品。Ｃ端特异的人Ｄｂｆ４多肽的氨基酸序列为：ＶＱＳＬＬＤＬＦＱＴＳＥＥＫＳ。抗人Ｄｂｆ４多肽抗体按以下方法制备：（１）人Ｄｂｆ４抗原表位的分析；（２）人Ｄｂｆ４ Ｃ端多肽的合成；（３）合成多肽与载体蛋白交联；（４）制备兔抗人Ｄｂｆ４多肽抗体；（５）收集、分离得到含有抗体的血清，纯化抗体，即得到抗人Ｄｂｆ４多肽抗体。本发明专利技术制备的Ｃ端特异的抗人Ｄｂｆ４合成多肽抗体效价高、亲和力强、特异性好，可与天然人Ｄｂｆ４发生特异性结合反应；制备成本低；纯化后的抗体可完全用于免疫印迹和酶联免疫吸附实验，以及建立体外免疫分析方法。该抗体为研究Ｄｂｆ４在细胞周期中的生物学作用提供了较为有用的工具。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及以抗体为特征的体外试验用的生物制品，具体是一种C端特 异的Dbf4多肽及其抗体制备方法，属于生物医学
技术介绍
Dbf4 (activatorofS phase kinase)做为CDC7的一个调节亚基在激活其激酶活性的过程中发挥作用，它是细胞进入S期必需的。CDC7-DBF4的复 合物选择性地将染色质相关的MCM复合物亚基MCM2进行磷酸化，然后参与 调控细胞周期中DNA复制的启动。
技术实现思路
本专利技术是为解决通过免疫实验特异性检测Dbf4的表达与天然存在，并 建、t相应体外免疫分析所需基本生物制品的问题，而提供的一种能特异性针 对Dbf4的C端的合成多肽、相应抗体及其制备方法。本专利技术还可同时解决 A前使用的类似抗体价格高，亲和力低，抗体结合蛋白的位置不特异且抗原性较差等问题。本专利技术所述的抗Dbf4合成多肽、相应抗体，按照以下步骤 制备抗原表位分析与拮抗位置确定利用多种表位预测软件，如DNAstar， OMIGA， UWGCG等进行综合分析，主要考量指标包括亲水性结构、抗原 指数、表面可及性等，再结合我们已有实际制备抗体的验证经验，最终确定 第619到第629位为该抗体的靶标，其氨基酸序列为VQSLLDLFQTSEEKS。多肽的合成靶标多肽采用全自动多通道多肽合成仪合成，柱层析纯化， 然后通过HPLC，用每分钟1。/。的标准乙晴梯度来检测纯度。多肽与载体蛋白交联由于本合成多肽分子量太小，在动物体内不能诱导产 生免疫反应，因此将多肽与载体蛋白交联后才能进行免疫，选择钥孔嘁血蓝 素进行交联，能显著增加抗原的大小和免疫原性，从而制备出人工免疫原。免疫动物所述的制备方法，其抗原肽-交联载体蛋白做为免疫原，免疫家兔制备抗体。选取适龄免疫用新西兰兔，经过适应性饲养后进行多点注射 免疫。反复加强免疫，至取血测抗体效价达到标准时停止免疫。抗体纯化达到要求的免疫动物放血，标准方法收集抗血清，依次使用辛酸-硫酸铵方法和亲和层析过柱纯化方法，进行抗血清纯化，通过SDS-PAGE 和HPLC验证纯度，得到F!标抗体。本专利技术制备的高质量多肽抗体效价高、亲和力强，可与天然Dbf4分子 发生特异性结合反应。用多肽制备抗体的成本较常规的重组抗原制备抗体方 法低，抗体特异性好，经亲和层析纯化后可以用于各种酶免检测和WB试验要求，可用于建立体外免疫分析。该合成肽抗体的制备，为Dbf4分子的研 究及其相关疾病的研究(如诊断策略的制定，流行病学调查、预防和控制) 提供了--个重要的T.具，以及在生物医学研究中对相应靶蛋白的特性、含量测定、分布情况的分析和蛋白的确证等方面都具有重要作用。 附图说明图1是液相色谱鉴定合成多肽纯度结果图。 图2是质谱鉴定合成多肽分子量结果图。图3是通过间接ELISA方法鉴定纯化抗体相对亲和常数结果图。图1表明经过HPLC对合成的多肽进行纯化后，液相色谱鉴定纯度为 85.2%。图2表明多肽分子量理论值为1826.1,质谱鉴定实测值M+H+为 1827.3。图3中ELISA检测制备的多抗和多肽抗原亲和常数为107-108L/mol。具体实施方式实施例1: Dbf4抗原肽的合成。用DNAstar， OMIGA, UWGCG等蛋白分析软件，对Dbf4氨基酸序列迸行亲水性结构(hydrophilicity)、抗原指数(antigenicity)、表面可及性(surface probability)以及同源性(homology)等分析，再结合我们己有实 际制备抗体的验证经验，最终确定第619到第629位为耙标，其氨基酸序列 为VQSLLDLFQTSEEKS。在全自动多肽合成仪上由固定羧基向氨基端递减 合成后获得粗品。经30%乙睛溶解后，进行高压液相色谱(HPLC)分析， 计算主峰面积并收集，经冷冻真空抽干后纯化合成肽，质谱鉴定。实施例2:合成多肽与载体的偶联。载体蛋白选择KLH (Keyhole limpet hemocyanin)，用双功能试剂 顺丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯(MBS)连接法将KLH与合成肽进行偶联 取KLH5mg (O."jjmol，含赖氨酸2.2jjmol)，溶于0.75mL偶联缓冲液 1 (50mmol/L硼酸盐缓冲液，pH8.5) ; 3mg MBS ("jjmo)溶于75yL 二甲酰胺(DMF)。将MBS溶液分3次加入KLH溶液，旋转混匀，室温下 作用30分钟。迅速离心后，将反应混合物(约0.8mL)加入预先用偶联缓 冲液2 (0.1mol/L磷酸盐，0.15m ol/LNaCL， 0.01mol/LNa2EDTA， pH7.0) 平衡的PD-10柱。用偶联缓冲液2洗脱，收集洗脱液(即MBS-KLH溶液)。 溶解1.5mg合成多肽于0.15mL偶联缓冲液2，加入MBS-KLH缓冲液0.56， 审温下旋转混合，作用2小时后置4 °C过夜，将反应混合物(约0.7mL) 加入预先用磷酸缓冲液平衡的PD-10柱，磷酸缓冲液洗脱，收集流出液。将 KLH、 MBS-KLH和偶联物进行SDS-KLH和偶联物进行SDS-PAGE (聚丙 烯酰胺凝胶电泳)鉴定偶联效率。实施例3:抗多肽抗体的制备。取偶联的klh-多肽50(Hjg，溶于500jjL磷酸缓冲液，加等体积完全福 氏佐剂。兔疾选取适龄免疫用新西兰兔(体重标准为2-2.5公斤)，经过适 应性饲养后，背部皮内不少于15点注射。2周后抗原量减半(250yg)，加 等体积的不完全福氏佐剂，第一次加强免疫。2周后进行第二次加强免疫， 方法同前。再2周后耳缘静脉少量采血，用合成多肽(1yg/mU包被酶标 板，间接ELISA法检测免疫血清效价。反复加强免疫，至取血测抗体效价达 到1: 16万时停止免疫，采用颈动脉放血收集抗体。实施例4:亲和层析纯化抗多肽抗体。① Dbf4合成多肽亲和层析柱的制备称取1.5g CNBr活化Sepharose 4B，用1mmol/L盐酸充分浸洗膨胀凝胶后，再用偶联缓冲液洗2次，迅速 与溶于5mL偶联缓冲液的合成多肽500pg混合，室温下旋转混合2小时。 加入0.2mol/L甘氨酸4mL终止反应，室温下旋转混合1小时。用偶联缓冲 液和甘氨酸缓冲液交替洗凝胶各2次，再用50mL磷酸盐缓冲液洗凝胶，按 终止浓度0.02%加叠氮钠(NaN3)，置4。C保存。② 亲和层析纯化抗多肽抗体:将20mL兔抗多肽血清与1.6mL多肽偶联 的Sepharose 4B共同加入50mL离心管，4。C旋转混合6小时。将凝胶加 入层析柱，弃去流出液，用15mL磷酸盐缓冲液冲洗凝胶。每次加0.8mL pH2.9， 0.1mol/L甘氨酸缓冲液洗脱，共8次，洗脱液分别加入8支预先加 入80jiL2mol/LTris-HCL缓冲液(pH7.5) ， 20mL磷酸盐缓冲液洗凝胶。上述全部操作过程在4°C下完成。每管取洗脱液2jjL，稀释50倍后测2S0nm的OD值，计算蛋白质含量并绘制洗脱曲线。实施例5:抗体的鉴定，使用间接ELISA方法检测抗体相对亲和常数。用合成肽交联BSA,分别以5 ug/mL和10 ug/mL的浓度，在4度 下包被ELISA检测板过夜，10。/。的山羊血清室温封闭2小时后加入倍比稀释 的已知蛋白浓度的纯化后的抗体，再本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种Ｃ端特异的人Ｄｂｆ４多肽，其特征在于多肽的氨基酸序列为：ＶＱＳＬＬＤＬＦＱＴＳＥＥＫＳ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈光宇，杜宏武，
申请(专利权)人：北京意宏安生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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