一种无标记神经降压素受体(NTSR)配体筛选模型制造技术

本发明专利技术涉及无标记G蛋白偶联受体(GPCR)配体筛选模型的构建及其应用，具体地说是涉及一种无标记神经降压素受体(NTSR)配体筛选模型。本发明专利技术利用HT29细胞内源性表达神经降压素受体的特点，利用无标记细胞整合药理学技术，建立了筛选NTSR的激动剂、拮抗剂的方法。该方法还可以用于研究NTSR药物的通路偏向性。本发明专利技术所建立的无标记NTSR配体和药物筛选模型具有新颖、高灵敏度、可靠、操作简便、实验周期短、对细胞无伤害、多靶点多通路研究及能高通量筛选等特点，对于寻找基于NTSR的配体和与NTSR密切相关的疾病的药物具有重大意义。

A marker free receptor for neurotensin (NTSR) ligand screening model

The invention relates to the construction and application of an unlabeled G protein coupled receptor (GPCR) ligand screening model, in particular to a marker free neurotensin receptor (NTSR) ligand screening model. The invention utilizes the characteristics of the endogenous expression of neurotensin receptor in HT29 cells, and establishes a method for screening NTSR agonists and antagonists by using unlabeled cell integration pharmacological techniques. The method can also be used to investigate the route preference of NTSR drugs. No labeled NTSR ligand and drug screening model is novel, high sensitivity, reliability, simple operation, short experimental period, no damage on the cell, multi-target pathway and high-throughput screening characteristics can be set up by the invention, is of great significance to find a drug based on the ligand of NTSR and NTSR is closely related to the disease.

【技术实现步骤摘要】
一种无标记神经降压素受体(NTSR)配体筛选模型
本专利技术涉及无标记GPCR配体筛选模型的建立，具体地说是一种无标记神经降压素受体(NTSR)配体筛选模型。所述GPCR为NTSR；所述方法为无标记细胞整合药理学技术；所述应用为NTSR配体的筛选，以及与NTSR相关的心血管疾病、高血压、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌以及胰腺癌等疾病的预防和治疗。
技术介绍
神经降压素受体(neurotensinreceptor,NTSR)是神经降压素(neurotensin,NTS)的特异性受体，是G蛋白偶联受体(Gprotein-coupledreceptors,GPCRs)家族成员中的一种，在中枢神经系统主要分布在大脑内侧隔核、斜角带布神经元、前脑基底核、脑黑质、海马和下丘脑核等区域，在外周组织主要分布在胃肠道等组织。NT与NTSR具有使血管扩张、降血压、调节多巴胺神经传导、减弱脑部神经活动、调节情绪、刺激垂体腺分泌激素、刺激胆囊分泌胆汁、抑制小肠和胃的蠕动、刺激胰腺分泌胰液、刺激结肠运动、以及对胃肠道等许多组织的营养与修复作用的生理功能。NTS及NTSR能刺激多种正常的组织及细胞生长、增殖。但是研究发现在胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌以及胃癌等癌细胞中发现了NTSR高表达。因此寻找发现针对NTSR的高活性特异性激动剂和拮抗剂是非常必要的(CarrawayR,LeemanSE.IsolationofaNewHypotensivePeptide,Neurotensin,fromBovineHypothalami.JournalofBiologicalChemistry,1973,248(19):6854-6861；VincentJP,MazellaJ,KitabgiP.Neurotensinandneurotensinreceptors.Trendsinpharmacologicalsciences,1999,20(7):302-309；PoppE,SchneiderA,VogelP,etal.Timecourseofthehypothermicresponsetocontinuouslyadministeredneurotensin.Neuropeptides,2007,41(5):349-354；St-GelaisF,JompheC,TrudeauLE.Theroleofneurotensinincentralnervoussystempathophysiology:Whatistheevidence？JPsychiatrNeurosci,2006,31(4):229-245；MustainWC,RychahouPG,EversBM.Theroleofneurotensininphysiologicandpathologicprocesses.CurrOpinEndocrinol,2011,18(1):75-82)。目前NTSR配体的筛选主要是采用荧光标记、酶联免疫法、荧光标记和荧光成像读板仪等法(FluorescenceImagePlateReader,FLIPR)等传统方法。但是这些方法都有缺点或自身局限性，例如反射自显影技术有操作复杂、通量低等缺点；荧光标记方法有需要特定的荧光、操作繁琐、灵敏度低以及无法实现高通量等缺点；酶联免疫法有操作繁琐、实验周期长、灵敏度低及低通量等特点；FLIPR是唯一一个能实现高通量、快速筛选配体的检测技术，但是其具有只能针对钙流及膜电位检测的局限性，无法直接针对受体，也不能进行通路研究。而本模型采用的方法为最新的无标记细胞整合药理学(cellularlabel-freeintegrativepharmacology,CLIP)技术是采用光学感应技术对细胞内质量发生重置的过程通过光波长的位移来反应细胞内受体信号传导的技术，具有无伤害、高灵敏度、高通量、能多靶点多通路研究、实验周期短以及操作简单等特点。因此，采用CLIP技术建立NTSR无标记配体筛选模型可以大大提高NTSR配体筛选的效率，对于阐述NTS和NTSR的药理学和生理学功能具有重要意义，为与NTSR相关的疾病的靶向治疗提供指导(BottoJM,GuillemareE,VincentJP,etal.EffectsofSR48692onneurotensin-inducedcalcium-activatedchloridecurrentsintheXenopusoocyteexpressionsystem:Agonist-likeactivityonthelevocabastine-sensitiveneurotensinreceptorandabsenceofantagonisteffectonthelevocabastineinsensitiveneurotensinreceptor.NeurosciLett,1997,223(3):193-196；MartinS,NavarroV,VincentJP,etal.Neurotensinreceptor-1and-3complexmodulatesthecellularsignalingofneurotensinintheHT29cellline.Gastroenterology,2002,123(4):1135-1143；SehgalI,PowersS,HuntleyB,etal.NeurotensinIsanAutocrineTrophicFactor-StimulatedbyAndrogenWithdrawalinHumanProstate-Cancer.PNatlAcadSciUSA,1994,91(11):4673-4677；SeethalakshmiL,MitraSP,DobnerPR,etal.NeurotensinreceptorexpressioninprostatecancercelllineandgrowtheffectofNTatphysiologicalconcentrations.Prostate,1997,31(3):183-192；FangY.Non-invasiveopticalbiosensorforprobingcellsignaling.Sensors-Basel,2007,7(10):2316-2329；FangY,FrutosAG,VerklereenR.Label-freecell-basedassaysforGPCRscreening.CombChemHighTScr,2008,11(5):357-369；FangY,FerrieAM,FontaineNH,etal.Characteristicsofdynamicmassredistributionofepidermalgrowthfactorreceptorsignalinginlivingcellsmeasuredwithlabel-freeopticalbiosensors.Analyticalchemistry,2005,77(17):5720-5725)。目前关于采用无标记细胞整合药理学技术的NTSR配体筛选模型的内容尚未报道。
技术实现思路
本专利技术涉本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种无标记神经降压素受体(NTSR)配体筛选模型，其特征在于：在接种了HT29细胞的细胞培养板中陆续加入待测样品和神经降压素(NTS)，若在HT29细胞上NTS产生的DMR谱的强度随待测样品浓度的增加而减少，则表明样品可使NTS脱敏，可判断样品具有NTSR的激动或者拮抗活性。

【技术特征摘要】
1.一种无标记神经降压素受体(NTSR)配体筛选模型，其特征在于：在接种了HT29细胞的细胞培养板中陆续加入待测样品和神经降压素(NTS)，若在HT29细胞上NTS产生的DMR谱的强度随待测样品浓度的增加而减少，则表明样品可使NTS脱敏，可判断样品具有NTSR的激动或者拮抗活性。2.根据权利要求1所述的模型，其特征在于：所述细胞培养板为Epic光学生物传感器微孔板。3.根据权利要求1所述模型，其特征在于：所述细胞培养板中HT29细胞的接种密度为1.5～4.0×104个/孔，细胞培养液体积为10～60μL/孔。4.根据权利要求1所述的模型，其特征在于：具体步骤为：A)NTS以终浓度0.004～32nM加入到接种HT29细胞的细胞培养板，立即检测其DMR信号；B)将待测样品加入到接种了HT29细胞的细胞培养板，待测样品终浓度为0.01nM～100μM，立即测其DMR谱，若其DMR谱与步骤A)所得的DMR谱具有轮廓相似性；C)将不同浓度的NTSR拮抗剂SR48692或SR142948A以终浓度为4nM～40μM加入到接种HT29细胞的细胞培养板，室温处理HT29细胞30～60min，加入与步骤B)相同浓度的待测样品立即检测其DMR信号，若其DMR信...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁鑫淼，侯滔，张秀莉，史丽颖，何牮，王纪霞，魏来，曲腊腊，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21