一种细胞病理切片快速染色检测方法技术

一种细胞病理切片快速染色检测方法，采用特殊染色方法先对切片进行快速染色处理，细胞核和细胞质均能染上颜色，且颜色对比明显；通过检测软件转换通道及非线性校准，过滤细胞质颜色，准确测量细胞核DNA含量，同时采用高分辨率显微镜及数码彩色摄像头采集每个细胞核相应的细胞形态学图片，并合成完整的数字切片；根据单个及成团细胞核DNA含量变化，结合细胞形态学的特征改变判断病变。本发明专利技术采用了特殊的染色方法，细胞核和细胞质能在短时间内呈现清晰颜色，在DNA测量时，不仅可精确测量切片中所有单个独立细胞核，且能测量并记录成团细胞核，提高诊断敏感性和特异性；在DNA测量的同时完成整个切片扫描和数字化，方便远程进行诊断。

A rapid staining method for cell pathological sections

Rapid detection method for staining a cell pathological section, using special staining method to slices rapid dyeing processing, the nucleus and the cytoplasm were stained color, and color contrast; convert channel and nonlinear calibration by detecting software filtering cytoplasmic color, accurate measurement of nuclear DNA content, while the cell morphology and high resolution microscopy pictures digital color camera to capture every cell corresponding, and digital slice synthesis complete; according to the single and group changes of nuclear DNA content, combined with the characteristics of changes in cell morphology evaluated. The invention adopts a special staining method, the nucleus and the cytoplasm can present a clear color in a short period of time, measured in DNA, not only can accurately measure the sections of all single nucleus, and can measure and record into a group of nuclei, improve the diagnostic sensitivity and specificity; at the same time to complete the measurement of DNA slice scanning and digitization convenient, remote diagnosis.

【技术实现步骤摘要】
一种细胞病理切片快速染色检测方法
本专利技术涉及生物细胞、组织染色
及细胞学定性和DNA定量检测分析方法，具体是切片经过特殊染色后，同时进行定性和定量检测。
技术介绍
细胞病理作为现代病理学分支部分，因其取材方便、相对无创，检测快速且经济实用，越来越受到关注。传统的细胞检测方法是指检测者在显微镜下通过观察细胞形态特征的变化，从而判断细胞是否发生病变。为了对细胞有效观察，在检测之前通常需要对细胞进行染色，常用的染色方法有苏木素伊红染色法、巴氏染色法、邵氏染色法等。这些方法多依据不同细胞器的酸碱性不同，从而结合不同颜色的染料，以便在显微镜下区分细胞膜、细胞浆以及细胞核以及细胞其他结构的一些变化。这种形态学分析只能为观察者呈现出一些细胞特征（如细胞核大小、核浆比或者细胞核颗粒存在情况等）。由于个体的差异性，导致细胞形态复杂多变，能否准确判断和解读形态变化究竟是否真正的病变，主要取决于细胞学医生的经验和资质,因此，检测结果主观性较强可重复性不好。由于肉眼辨识度的限制，也很难区分交界性病变的性质，或是无法发现一些形态学变化不典型的病变，会不可避免造成一定数量漏诊的病例。染色体是一部完整的生命百科全书，每个物种都有一套独特的染色体（即染色体组），对于物种的存在，染色体具有决定性作用。同时，精细的有丝分裂机制，也保证了染色体在细胞传代过程中，数量和结构始终保持稳定。但致癌物质、罕见的遗传病症以及偶发的有丝分裂错误可能使这种稳定状态遭到破坏。19世纪末20世纪初，DavidvonHansemann和TheodorBoveriVonHansemann发现所有癌细胞都含有异常染色体。随着检测技术的进步，越来越多数据表明：癌细胞以及正在癌变的也就是病变细胞都会违背“染色体组稳定”这一自然法则，通过产生数量异常染色体的细胞引发肿瘤。染色体的异常数量使得数以千计的基因和它们编码的蛋白质处于失衡状态，从而使细胞产生恶性表型，也为细胞发展成为更严重的染色体异常细胞创造了条件。癌细胞染色体数目异常程度越高，染色体变异速度越快,因此可通过对细胞核内染色体数目或DNA含量的变化测定来判断细胞的病变情况,这属于定量检测。先通过DNA特异性染色，对细胞DNA进行标记，由于染色为化学反应，可在标记物多少和DNA含量之间建立线性关系，通过检测标记物的多少，判断DNA含量大小。这种方法能在病变早期发现遗传物质的变化，敏感性好；检测由设备进行，与操作人员的经验或资质无关，避免了主观因素造成的误差，结果可重复性好。但这种检测中使用的染色方法造成检测时只能看到细胞核，在缺乏细胞浆的情况下，无法判断病变细胞类型。此外，在复核细胞核时，也会因为没有细胞浆，但凭借染色的核很难区分是标本中的杂质还是真正的细胞核，如果将杂质误判为诊断细胞，也会造成误诊。DNA测量的图像分析对多个细胞核重叠即成团核的分割是难点，通常直接跳过这类细胞，不识别，这会导致漏诊。因此，细胞形态学定性分析的方法染色时间短，流程简单，但不稳定，对技术员要求高，诊断只基于细胞的形态学特征，依赖细胞学家的经验和技巧，误诊率非常高；DNA定量分析方法基于DNA特异的染色方法，染色时间长，染色条件要求高，试剂不稳定。DNA测量依赖于细胞核的特征，对单个细胞核能很好的分割测量，对于多个细胞核重叠即成团核的分割测量是DNA定量分析的难点，通常直接跳过这类细胞，不识别，且不能提供任何关于细胞形态学方面的信息。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种细胞病理切片快速染色检测方法，使染色时间短，流程简单，染色后切片可同时进行细胞形态学分析和细胞核DNA定量检测，提高病变细胞检测的准确度。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种细胞病理切片快速染色检测方法，包括以下步骤：第1步：对切片进行染色处理，使细胞核和细胞质均染上颜色，并且两者所染颜色对比明显，保证在捕捉到的图像中，细胞核和细胞质都能清晰呈现；第2步：通过检测软件转换通道及非线性校准，过滤细胞质颜色，准确测量细胞核DNA含量，同时采用高分辨率显微镜及数码彩色摄像头采集采集每个细胞核相应的细胞形态学图片及合成完整数字切片；第3步：根据单个及成团细胞核DNA含量变化结合细胞形态学的变化判断病变细胞。上述第1步中染色处理包括：步骤a：将制好的标本自然干燥；步骤b：将干燥的切片置预处理液中固定10-30分钟，然后流水洗涤4-5次；步骤c：经过步骤b处理的标本放入50～55℃的盐酸液中酸化5-10分钟，然后流水洗涤4-5次；步骤d：经过步骤c酸化的标本放入50～55℃的特殊染色液A中染色5-15分钟，然后流水洗涤4-5次；步骤e：经过步骤d染色的标本用蒸馏水浸洗5分钟；步骤f：经过步骤d浸洗的标本依次放入50%酒精内脱水2分钟，75%酒精内脱水2分钟，95%酒精内脱水3分钟；步骤g：经过步骤f逐级脱水后的标本置于特殊染色液B中染色1-5分钟；步骤h：经过步骤g染色的标本在无水乙醇浸泡两次，每次3分钟；步骤i：经过步骤h的标本用树胶盖片封固。上述染色处理中使用的试剂包括预处理液、盐酸液、特殊染色液A和特殊染色液B，其中：所述预处理液采用AF液、4%多聚甲醛、10%中性甲醛、95%乙醇、BS液中的任意一种或一种以上；所述盐酸液按质量百分比包含35%～45%浓盐酸、55%～65%蒸馏水；所述特殊染色液A按质量百分比包含0.10%～1%吩噻嗪类染料、1.8%～2.2%盐酸液、0.09%～0.12%偏重亚硫酸钠、剩余质量百分比由蒸馏水补足，所述吩噻嗪类染料由次甲基蓝、天青A、硫堇中的一种或一种以上组成；所述的特殊染色液B按质量百分比包含0.005%～0.1%酸性染料、75%～96%醇类试剂、剩余质量百分比由蒸馏水补足，所述酸性染料由伊红、油红O、丽春红2R、比布列西猩红中的一种或一种以上组成，醇类试剂由乙醇、甲醇、异丙醇、叔丁醇、乙二醇中的一种或一种以上组成。上述描述的各个试剂个组分的体积和质量指数提供一种比例关系，并不表示本专利技术中各个试剂只能用上述的体积和质量。优选的，上述步骤中的最佳的处理时间为：步骤b固定15分钟，步骤c酸化7分钟，步骤d染色10分钟，步骤f染色3分钟。第2步中检测软件上将原始绿通道转换为红通道，过滤细胞质颜色；非线性校正过程包括调整光源亮度、图像曝光值、图像灰度偏移值、图像分割阈值补偿参数、贝尔模式（Bayer）模型解析参数、指数模型变换等参数，从而准确测量细胞核DNA含量。非线性校正的过程具体如下：步骤（1）：设置一组指数模型变换调节参数、贝尔模式（Bayer）解析调节参数和图像分割阈值补偿参数；步骤（2）：按常规显微镜调节方式调节DNA检测设备照明、视场光阑、孔径光阑，调节曝光时间在指定的范围区间，图像直方图展示图像亮暗状态在非饱和范围；步骤（3）：放置一标准切片并设置一个扫描区域，扫描完成后，检查标准切片的IOD（积分光密度）、二倍体细胞标准方差CV，以确定DNA检测设备分辨率是否正常，计算四倍体IOD与二倍体IOD的比值是否符线性关系。将以上参数和质控系统的扫描参数对比，以质控设备为标准，调节指数模型变换参数和Bayer解析参数；步骤（4）：重复上述步骤（1）-（3），直到同一张标准切片的扫描参数本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞病理切片快速染色检测方法，其特征在于，包括以下步骤：第1步：对切片进行染色处理，使细胞核和细胞质均染上颜色，并且两者所染颜色对比明显，保证在捕捉到的图像中，细胞核和细胞质都能清晰呈现；第2步：通过检测软件转换通道及非线性校准，过滤细胞质颜色，准确测量细胞核DNA含量，同时采用高分辨率显微镜及数码彩色摄像头采集采集每个细胞核相应的细胞形态学图片及合成完整数字切片；第3步：根据单个及成团细胞核DNA含量变化结合细胞形态学的变化判断病变细胞；上述第1步中染色处理包括：步骤a：将制好的标本自然干燥；步骤b：将干燥的切片置预处理液中固定10‑30分钟，然后流水洗涤4‑5次；步骤c：经过步骤b处理的标本放入50～55℃的盐酸液中酸化5‑10分钟，然后流水洗涤4‑5次；步骤d：经过步骤c酸化的标本放入50～55℃的特殊染色液A中染色5‑15分钟，然后流水洗涤4‑5次；步骤e：经过步骤d染色的标本用蒸馏水浸洗5分钟；步骤f：经过步骤d浸洗的标本依次放入50%酒精内脱水2分钟，75%酒精内脱水2分钟，95%酒精内脱水3分钟；步骤g：经过步骤f逐级脱水后的标本置于特殊染色液B中染色1‑5分钟；步骤h：经过步骤g染色的标本在无水乙醇浸泡两次，每次3分钟；步骤i：经过步骤h的标本用树胶盖片封固。...

【技术特征摘要】
1.一种细胞病理切片快速染色检测方法，其特征在于，包括以下步骤：第1步：对切片进行染色处理，使细胞核和细胞质均染上颜色，并且两者所染颜色对比明显，保证在捕捉到的图像中，细胞核和细胞质都能清晰呈现；第2步：通过检测软件转换通道及非线性校准，过滤细胞质颜色，准确测量细胞核DNA含量，同时采用高分辨率显微镜及数码彩色摄像头采集采集每个细胞核相应的细胞形态学图片及合成完整数字切片；第3步：根据单个及成团细胞核DNA含量变化结合细胞形态学的变化判断病变细胞；上述第1步中染色处理包括：步骤a：将制好的标本自然干燥；步骤b：将干燥的切片置预处理液中固定10-30分钟，然后流水洗涤4-5次；步骤c：经过步骤b处理的标本放入50～55℃的盐酸液中酸化5-10分钟，然后流水洗涤4-5次；步骤d：经过步骤c酸化的标本放入50～55℃的特殊染色液A中染色5-15分钟，然后流水洗涤4-5次；步骤e：经过步骤d染色的标本用蒸馏水浸洗5分钟；步骤f：经过步骤d浸洗的标本依次放入50%酒精内脱水2分钟，75%酒精内脱水2分钟，95%酒精内脱水3分钟；步骤g：经过步骤f逐级脱水后的标本置于特殊染色液B中染色1-5分钟；步骤h：经过步骤g染色的标本在无水乙醇浸泡两次，每次3分钟；步骤i：经过步骤h的标本用树胶盖片封固。2.根据权利要求1所述的一种细胞病理切片快速染色检测方法，其特征在于，染色处理中使用的试剂包括预处理液、盐酸液、特殊染色液A和特殊染色液B，其中：所述预处理液采用AF液、4%多聚甲醛、10%中性甲醛、95%乙醇、BS液中的任意一种或一种以上；所述盐酸液按质量百分比包含35%～45%浓盐酸、55%～65%蒸馏水；所述特殊染色液A按质量百分比包含0.10%～1%吩噻嗪类染料、1.8%～2.2%盐酸液、0.09%～0.12%偏重亚硫酸钠、剩余质量百分比由蒸馏水补足，所述吩噻嗪类染料由次甲基蓝、天青A、硫堇中的一种或一种以上组成；所述的特殊染色液B按质量百分比包含0.005%～0.1%酸性染料、75%～96%醇类试剂、剩余质量百分比由蒸馏水补足，所述酸性染料由伊红、油红O、丽春红2R、比布列西猩红中的一种或一种以上组成，醇类试剂由乙醇、甲醇、异丙醇、叔丁醇、乙二醇中的一种或一种以上组成。3.根据权利要求1所述的一种细胞病理切片...

【专利技术属性】
技术研发人员：余岚岚，贾守礼，周倩，陈进，朱晨雁，黄荣祥，
申请(专利权)人：麦克奥迪厦门医疗诊断系统有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35