一种同时检测EGFR多种顺式反式突变组合的引物探针序列组合、试剂盒、方法及应用技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，特别涉及一种同时检测EGFR多种顺式反式突变组合的引物探针序列组合、试剂盒、方法及应用。所述引物探针序列组合包括SEQ ID NO:1

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测EGFR多种顺式反式突变组合的引物探针序列组合、试剂盒、方法及应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，特别涉及一种引物探针序列组合、试剂盒、方法及应用，尤其涉及一种同时检测EGFR多种顺式反式突变组合的引物探针序列组合、试剂盒、方法及应用。

技术介绍

[0002]针对EGFR突变的靶向药物，第一代和第二代EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR
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TKI)如厄洛替尼，吉非替尼等是目前较普及和疗效较好的药物。然而，第一代和第二代EGFR
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TKI应用后多数患者在1
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2年内出现抗药性，肿瘤复发生长。出现抗药的原因是药物靶点EGFR出现了新的抗药性基因突变(如EGFR T790M等)。原来的EGFR药物敏感基因突变可能消失或与新的抗药基因突变同时存在。针对新的突变EGFR T790M，第三代抗EGFR
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TKI(如奥希替尼)已经在中国获批使用。奥希替尼使用1
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2年后也会出现新的基因突变并产生抗药。目前国内外尚无第四代靶向药物研制成功。对EGFR
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TKI抗药基因的研究证明使用第一代和第二代EGFR
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TKI如厄洛替尼，吉非替尼等产生的抗药基因主要为EGFR T790M(58％)。使用第三代EGFR
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TKI奥希替尼产生的抗药基因突变为EGFR C797突变，EGFR原发突变消失，EGFR基因扩增，MET扩增，HER2扩增，KRAS突变，PIK3CA突变，FGFR1基因扩增以及多发基因突变，组织学改变及其他为未知原因(图1)。尤其值得注意的是发生率较高的EGFR C797突变有两种不同类型：顺式和反式。顺式突变是指在原发T790M突变的顺位797位点发生突变，即两个突变发生在同一个基因模板上。反式突变是指新的 C797突变与原发T790M突变不发生在同一个基因模板上，即T790M突变与新发生的C797突变都存在，但出现在不同模板上(图2)。对顺式突变目前没有靶向药物可用，只能使用化疗。对反式则可以使用第一，第二代EGFR
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TKI与第三代EGFR
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TKI联合治疗。因此在出现EGFR C797突变后必须进行顺式或反式的检测。另外，在EGFR C797位点上，除了C797S突变之外，还会出现C797G、 G796S和G796R突变，而797,796位点的氨基酸改变可以由不同核苷酸碱基改变产生，如C797S(G>C)，C797S(T>A)，C797G(T>G)，G796S(G>A)，G796R(G>C) 等。目前应用PCR的检测只能检测C797S突变及其顺式、反式突变，忽略检测其他较低比率出现的突变。因为需要针对每种不同的突变设计对应的探针才能全面检出这些单个碱基改变及其复杂的组合，PCR检测将极为复杂。
[0003]然而，这些较低比率突变的总和高达15％以上，而且这些突变也会出现顺式和反式类型。对这部分突变检测的忽略，导致这部分患者的抗药基因突变无法检出而延误治疗。对顺式797,796位点突变，不论是那种碱基的突变和产生那种氨基酸，目前都没有特异性靶向药物，所以只需要检出是否发生突变，而无需检出是那种碱基和氨基酸突变。对反式突变仍然可以用第一，第二代EGFR
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TKI与第三代EGFR
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TKI联合治疗。
[0004]目前，对EGFR 790顺式和反式的检测方法有二代测序法(NGS)、数字PCR 法和荧光定量PCR法；其中NGS最为直观，通过测序得到的序列结果可以直观的看出在同一条模板上EGFR 790和796、797位置的碱基情况，从而推测顺式或反式的结果；数字PCR法是通过对设
计T790M和796、797所有对应突变的特异性探针，其中T790M使用一种荧光标记，而796、797所有突变探针使用另一种荧光标记，若在同一“微反应室”中只有一种荧光标记则为反式，反之有两种荧光标记则为顺式
[1]；荧光定量PCR法，主要为特异性扩增引物的ARMS
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PCR法和野生型扩增阻遏的WTB
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PCR法，通过不同的ARMS引物或阻遏探针的搭配组合来区分待检测位点属于哪种分型，进而判断检测结果为顺式还是反式。
[0005]现有技术的缺点：
[0006]1、基于NGS技术平台的检测方式存在耗时长、成本高和对人员操作技术要求高等缺点，不适宜随访病人的多次应用，追踪抗药基因的早期发现；
[0007]2、数字PCR需要对所有的变异都设计特异性的探针，太多的探针混合会造成非特异性扩增，高噪音，影响结果的判定；
[0008]3、目前应用的荧光定量PCR检测EGFR顺反式的方法为双阻遏探针法
[2
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3]，通过设计对790和797野生型进行封闭的阻遏探针，根据不同阻遏探针组合的检测结果来判断顺式反式，需要多管操作，且需要不加阻遏探针组做对照，操作繁琐。
[0009]引用专利文献
[0010][1]黄霖霆、曹乾升、俞莹等，用于检测T790M和C797S顺反式突变类型的探针组、试剂盒、反应体系及系统：中国，CN201811638547；
[0011][2]储天晴、陈曦、丁俐等，一种EGFR T790M和C797S顺式突变的检测方法：中国，CN201910315506.4；
[0012][3]唐东江、赵计昌、黄雅菁，检测EGFR
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T790M和EGFR
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C797S顺反式突变构型的方法和探针：中国，CN202010726064.5。

技术实现思路

[0013]本专利技术的目的是提供一种同时检测EGFR多种顺式反式突变组合的引物探针序列组合、试剂盒、方法及应用，本专利技术通过设计一种特异性阻遏探针，结合使用Taqman探针检测手段，可判断变异是否连锁，并且解决常规双阻遏探针法的繁琐操作，单次能检测出EGFR多种碱基同义突变和顺式或反式类型的情况。
[0014]为此，本专利技术技术方案如下：
[0015]第一方面，本专利技术提供一种同时检测EGFR多种顺式反式突变组合的引物探针序列组合，其特征在于，包括SEQ ID NO:1
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SEQ ID NO:5序列；
[0016]其中，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2为扩增引物对，SEQ ID NO:1为扩增上游引物，SEQ ID NO:2为扩增下游引物；所述扩增引物能特异性扩增包含EGFR 790
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797的片段，且所述引物中的下游引物与所述796
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797野生型特异性Blocker 存在至少3个重叠序列(overlap)；
[0017]SEQ ID NO:3为790突变型探针，SEQ ID NO:4为790野生型探针；
[0018]SEQ ID NO:5为796本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时检测EGFR多种顺式反式突变组合的引物探针序列组合，其特征在于，包括SEQ ID NO:1
‑
SEQ ID NO:5序列；其中，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2为扩增引物对，SEQ ID NO:1为扩增上游引物，SEQ ID NO:2为扩增下游引物；SEQ ID NO:3为790突变型探针，SEQ ID NO:4为790野生型探针；SEQ ID NO:5为796
‑
797特异性阻遏Blocker。2.根据权利要求1所述的引物探针序列组合，其特征在于，所述790突变型探针为特异性结合EGFR
‑
T790M突变型的探针，其中5
’
端标记有FAM荧光修饰，3
’
端标记有MGB淬灭修饰；所述790野生型探针为特异性结合EGFR
‑
790野生型的探针，其中5
’
端标记有HEX荧光修饰，3
’
端标记有BHQ1淬灭修饰。3.根据权利要求1或2所述的引物探针序列组合，其特征在于，在796
‑
797特异性阻遏Blocker容易发生突变的位置的碱基添加LNA修饰；在所述序列3
’
端添加C3 Spacer修饰；...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪炯志，富继义，
申请(专利权)人：麦克奥迪厦门医疗诊断系统有限公司，
类型：发明
国别省市：