哈蟆油真伪鉴别的方法及专用引物技术

本发明专利技术公开了哈蟆油真伪鉴别的方法及专用引物。本发明专利技术提供了本发明专利技术提供用于哈蟆油真伪鉴别的引物对，为能扩增出DNA片段A的引物对；所述DNA片段A是以哈蟆油为模板，用序列1和序列2所示引物对进行扩增得到的产物。本研究通过对位点特异性PCR进行条件优化，实现了在40min内简单、快速、直观的鉴别哈蟆油及其常见混伪品的目的，有助于实现哈蟆油药材现场、准确、快速鉴定。

Method for identification of Oviductus Ranae and special primer

The invention discloses a method for identification of Oviductus Ranae and special primer. The present invention provides for the identification of Oviductus Ranae primers, amplified DNA fragment for A primers; the DNA fragment is A in Oviductus Ranae as template, with sequence 1 and sequence 2 shows primer pairs amplified product. This study was optimized by allele specific PCR, realized in 40min is simple, fast and intuitive identification of Oviductus Ranae and common adulterants, contribute to the realization of the Oviductus Ranae medicine field, accurate, rapid identification.

【技术实现步骤摘要】
哈蟆油真伪鉴别的方法及专用引物
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种哈蟆油真伪鉴别的方法及专用引物。
技术介绍
哈蟆油(Ranaeoviductus)为蛙科动物中国林蛙(RanatemporariachensinensisDavid)雌蛙的输卵管，经采制干燥而得。具有补肾益精，养阴润肺的功效，用于病后体弱，神疲乏力，心悸失眠，盗汗，痨嗽咳血。是一种集食用药用于一身的名贵中药材。由于多方面原因导致哈蟆油严重的供不应求，致使伪品充斥于市。目前市场上的伪品哈蟆油主要有黑龙江林蛙油、青蛙油、蟾蜍油、牛蛙油4类，其它伪品类型少见。2015年版《中国药典》规定哈蟆油的鉴别方法为性状鉴定、高效液相色谱法鉴定及膨胀度测定法，但这些方法易受人为因素、环境条件或药材本身的限制，实践中哈蟆油的鉴定仍感到十分困难。随着分子生药学的发展，分子鉴定技术在哈蟆油药材的鉴别中得到不断的应用，很大程度上弥补了传统鉴别方法的不足。但是，已建立的哈蟆油分子鉴别方法，从模板的提取、PCR反应到最终结果分析，单个样品的鉴定步骤繁琐，耗时长，且需要电泳检测或序列分析比对，不利于现场快速鉴别的使用。随着分子生物学的发展，分子鉴定技术已成为中药材传统鉴别方法的有益补充。有关哈蟆油的PCR鉴别方法已有报道，但是由于哈蟆油药材本身遇水膨胀，给哈蟆油的DNA提取带来极大的困难，提取过程复杂，成功率低，制约了该方法的深入应用。快速PCR在保证PCR反应特异性和准确性的前提下，通过缩短反应时间来达到快速检测目的，尤其是和荧光检测技术相结合，进一步提高了检测效率，有望实现中药材的现场、快速检测。快速PCR技术和产物荧光检测的实现，对引物设计有严格的要求。为达到快速扩增的目的，设计引物时上下游引物距SNP位点尽可能近，PCR产物应尽可能短；引物Tm值与延伸温度接近，以减少PCR反应的升降温温差。为达到使用荧光检测的目的，引物设计应避免引物二聚体对检测结果的影响，这就要求引物质量要好，扩增过程中无引物二聚体的产生；使用的酶质量要好，能有效抑制引物二聚体的形成；有些情况下引物二聚体是不可避免的，可以通过调整酶、引物用量、加入PCR增强剂等方法，减少其对荧光检测结果的影响。近年来，快速PCR方法已成功用于金银花，蛇类，太子参，人参、西洋参等中药材的真伪鉴别。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供用于哈蟆油真伪鉴别的引物对。本专利技术提供的引物对，为能扩增出DNA片段A的引物对；所述DNA片段A是以哈蟆油为模板，用序列1和序列2所示引物对进行扩增得到的产物。上述引物对中，所述DNA片段A的核苷酸序列为序列5；或，所述引物对由引物1和引物2组成；所述引物1为如下1)或2)：1)为序列1所示的单链DNA分子；2)为序列1删除和/或增加和/或改变一个或几个核苷酸得到的单链DNA分子；所述引物2为如下3)或4)：3)为序列2所示的单链DNA分子；4)为序列2删除和/或增加和/或改变一个或几个核苷酸得到的单链DNA分子。本专利技术第二个目的是提供一种用于鉴定或辅助哈蟆油的PCR试剂。上述PCR试剂中，包括上述的引物对、DNA聚合酶和dNTP。上述PCR试剂中，所述引物对中每条引物在所述PCR试剂中的浓度均为2nmol/l；和/或，各个dNTP在所述PCR试剂中的浓度具体为2.5nmol/l；和/或，所述DNA聚合酶具体为SpeedStarHSTaqDNA聚合酶或PhantaMaxSuper-FidelityDNA聚合酶。本专利技术第三个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定哈蟆油的试剂盒。本专利技术提供的试剂盒，，包括上述的引物或上述的PCR试剂。上述DNA片段A也是本专利技术保护的范围。上述的引物或上述的PCR试剂或上述的试剂盒或上述的DNA片段A在如下(A1)-(A5)中任一种中的应用也是本专利技术保护的范围：(A1)鉴定或辅助鉴定哈蟆油；(A2)鉴别或辅助鉴别哈蟆油；(A3)鉴别或辅助鉴别哈蟆油及其伪品；(A4)鉴定或辅助鉴定待测样品是否为哈蟆油；(A5)鉴定或辅助鉴定待测样品是哈蟆油还是其伪品。本专利技术第四个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品是否为哈蟆油的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：检测待测样品中是否含有权利要求6所述的DNA片段A；如果含有，则待测样品为或候选为哈蟆油；如果不含有，则待测样品不为或候选不为哈蟆油。上述方法中，所述检测待测样品中是否含有DNA片段A的方法包括如下步骤：1)用上述的引物对待测样品进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；2)用如下a或b检测所述PCR扩增产物：a、向所述PCR扩增产物中加入DNA荧光染料，紫外检测，若PCR扩增产物有荧光，则待测样品含有所述DNA片段A，若PCR扩增产物无荧光，则待测样品不含有所述DNA片段A；b、检测所述PCR扩增产物大小，若大小为520-530bp，则所述待测样品含有所述DNA片段A，若大小不为520-530bp，则所述待测样品不含有所述DNA片段A。上述方法中，所述PCR扩增的模板为待测样品的基因组DNA；所述PCR扩增条件为90℃3s，62℃20s，32个循环。所述DNA片段A的核苷酸序列为序列表中序列5。所述引物1和所述引物2的摩尔比为1:1。所述PCR试剂由上述的引物对、DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液和水组成。所述伪品具体为黑龙江林蛙油、黑斑蛙油、蟾蜍油和/或牛蛙油。本项研究基于快速PCR方法对哈蟆油及其常见混伪品(黑龙江林蛙油、黑斑蛙油、蟾蜍油、牛蛙油)进行鉴别研究，有效的提高哈蟆油鉴别反应效率，为哈蟆油药材的鉴别提供更加符合实际需要、简便快捷的方法。上述待测样品通过碱裂解法获得DNA，整个提取过程仅需5min即可完成，为后续快速PCR方法的建立奠定了基础。本研究通过对位点特异性PCR进行条件优化，实现了在40min内简单、快速、直观的鉴别哈蟆油及其常见混伪品的目的，有助于实现哈蟆油药材现场、准确、快速鉴定。本研究对哈蟆油常见的4种蛙类混伪品进行了鉴别研究，对于哈蟆油非蛙类的伪品如：鳕鱼精巢及琼脂蛋白胨、马铃薯加工品没有涉及，因此本研究所建立方法对于非蛙类伪品的适用性有待于进一步研究。附图说明图1为mcb398/mcb869通用引物扩增。图2为引物筛选电泳图。图3为样品验证图。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中药材为收集不同产地中国林蛙10批、黑龙江林蛙4批、黑斑蛙4批、中华大蟾蜍4批，牛蛙2批、哈蟆油3批、牛蛙油1批。所有基原动物按传统加工方法分别制成哈蟆油、黑龙江林蛙油、黑斑蛙油、蟾蜍油、牛蛙油，另选取哈蟆油药材3批进行快速PCR方法研究。样品分别采自吉林、黑龙江、辽宁、内蒙古、山东、江苏、湖南、四川等地。经黑龙江中医药大学中药资源与开发教研室王振月教授鉴定，凭证标本保存于哈尔滨市食品药品检验检测中心，见表1。表1实验材料下述实施例中部分仪器如下：S1000型梯度PCR仪(Bio-rad公司)；ETC811型PCR仪(东胜兴业科学仪器有限公司)；22R型高速冷冻微量离心机(Beckman公司)；ZH-2型漩涡震荡器(天津药典标准仪器厂)；MM400型球磨机(Retsch公司)；DYY-6C型电泳仪本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于哈蟆油真伪鉴别的引物对，为能扩增出DNA片段A的引物对；所述DNA片段A是以哈蟆油为模板，用序列1和序列2所示引物对进行扩增得到的产物。

【技术特征摘要】
1.用于哈蟆油真伪鉴别的引物对，为能扩增出DNA片段A的引物对；所述DNA片段A是以哈蟆油为模板，用序列1和序列2所示引物对进行扩增得到的产物。2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于：所述DNA片段A的核苷酸序列为序列5；或，所述引物对由引物1和引物2组成；所述引物1为如下1)或2)：1)为序列1所示的单链DNA分子；2)为序列1删除和/或增加和/或改变一个或几个核苷酸得到的单链DNA分子；所述引物2为如下3)或4)：3)为序列2所示的单链DNA分子；4)为序列2删除和/或增加和/或改变一个或几个核苷酸得到的单链DNA分子。3.一种用于鉴定或辅助哈蟆油的PCR试剂，包括权利要求1或2所述的引物对、DNA聚合酶和dNTP。4.根据权利要求3所述的PCR试剂，其特征在于：所述引物对中每条引物在所述PCR试剂中的浓度均为2nmol/l；和/或，各个dNTP在所述PCR试剂中的浓度具体为2.5nmol/l；和/或，所述DNA聚合酶具体为SpeedStarHSTaqDNA聚合酶或PhantaMaxSuper-FidelityDNA聚合酶。5.一种鉴定或辅助鉴定哈蟆油的试剂盒，包括权利要求1或2所述的引物或权利要求3或4所述的PCR试剂。6.权利要求1或2所述的引物中的所述DNA片段A。7.权利要求1或2所述的引物或权利要求3或4所述的PCR试剂或权利要求5所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄璐琦，袁媛，何志一，唐先明，蒋超，赵玉洋，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11