制备活性炭-GM1络合物的方法技术

本发明专利技术提供制备在不同ｐＨ条件下稳定的吸附活性炭－ＧＭ１络合物的方法。该方法基于被例举的悬浮液配制方法。本发明专利技术也公开了使用高效液相层析测定水溶液中的未衍生的ＧＭ１的分析方法。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及活性炭-GM1络合物的制备方法和设计用来通过高效液相色谱法(HPLC)测定在水溶液中未衍生的GM1的分析方法。该络合物可以用作霍乱治疗中的辅助剂，它中和相应的毒素。而且，体外试验证明它可能作为亚铁离子中毒的解毒剂。为了评定制备活性炭-GM1络合物的方法的效率，已经发展了使用分析未衍生形式的神经节苷脂的新的溶剂系统，通过HPLC测定GM1的分析方法。该等浓度系统可有利地对实施文献所述的方法进行分析。得到本申请公开的活性炭-GM1络合物的方法被开发用于寻求在胃肠道pH条件下得到的产品的稳定性，由此促进它的安全性。
技术介绍
领域导致肠道感染的细菌，导致腹泻，痢疾和伤寒，是引起严重的健康问题的原因。这类最重要的病理当中，我们使用霍乱，由来自革兰氏阴性细菌霍乱弧菌01的肠毒素作用产生的病理症状。与小肠近端部分的粘液良好结合的微生物生产了这些毒素。这些毒素呈现为由相同的5个较小的亚单位(亚单位B)形成的环平面分离的亚单位A。它的分子量大约为84,000，各亚单位B分子量当量为11,000，亚单位A被分成A1(PM＝24,000)和A2(PM＝5,000)。B五聚体与肠上皮细胞膜中的GM1神经节苷脂有关。亚单位A被插入细胞质中，从而释放A1片断，激活潜在的腺苷酸-环化酶。结果迅速增加环-AMP的产生。这些及其他因素的结果为肠腔中盐和水过度积聚以及细胞死亡. 神经节苷脂-GM1为霍乱毒素的特异受体。GM1亦称单唾液酰神经节苷脂，属于glicosphingolipids类，由于唾液酸的存在而与该类其他组分区别(与其他神经节苷脂一起)。如下文所示，它的结构显示疏水和亲水区域。第一部分由鞘氨醇和硬脂酸构成的神经酰胺组成以及亲水部分由唾液酸寡糖链表示。这些特征可以提供胶粒的构造，人们相信唾液酸(sialic)片段与具有毒素的神经节苷脂的活性有关。神经节苷脂GM1 鉴于它的霍乱毒素特性，GM1能通过中和肠腔中的毒素用于治疗毒性感染。这已由STOLL等在开发活性炭-GM1吸附性络合物时试验。尽管这样，应当指出，该作者引用的得到该络合物的方法并未公开，并且该络合物的流程的稳定性的研究也未公开。因此，在该文献中未公开获得该络合物的方法，上述工作集中于通过该络合物产生有益的治疗的分析或霍乱常规治疗的分析上。目前，霍乱治疗包括抗菌治疗的消毒，疫苗的应用，以及减轻由感染所引起的症状的不同方法。在这方面，络合物的使用是该治疗的重要的补充。针对该化合物应用的安全性，开发使用它的在类似于胃肠道中的pH值的环境下同样稳定的方法是必不可少的。这特别是由于在肠细胞膜中掺入GM1通过增加受体的数目而增加了对霍乱毒素的生物反应。为了实施制备活性炭-GM1络合物的方法，显然人们应该分别确定该络合物、活性炭和GM1的基本组分的数量和纯度。因此本专利技术也包含测定水溶液中的GM1的新方法。上述的技术已经使用梯度洗脱系统的HPLC，有时将受设备产生的限制。下列表1概括了文献中公开的方法。表1-非衍生的神经节苷脂的色谱分析参数。文献中公开的分析方法(HPLC)的比较表。柱 溶剂系统 λ(探测) 平均分析 参考文献(compr.XD.l.x D.part.)(等浓度的/梯度的) 时间胺柱乙腈-缓冲液215nm80min GAZZOT等3(LiChrosorb-NH2) 磷酸盐5mM，pH(25cm×4mm×7μm) 5，6(梯度)硅(aquasil SS-正已醇-异 208nm25minANDO等1542N)丙醇-氯化钾(20cm×6mm×5μm) 5mM(梯度)硅(aquasil SS- 乙腈-异丙醇 208min 30minANDO等2542N) -氯化钾(20cm×6mm×5μm) 50mM梯度胺柱 乙腈-dissodic 215nm1h 20min PREVITI等4(LiChrosorb-NH2) 磷丙盐，磷酸缓冲液(25cm×4mm×5μm) Ph5，6梯度1-ANDO，S.，WAKI，H.，K.ON，High-performance liquidchromatography of undenvatized gangliosides(未衍生的神经节苷脂的高效液相层析).《色层学杂志》J.Chromatogr.，Amsterdam，v.408，p.285-290，1987。2-ANDO，S.，WAKI，H.，KON，K..New solvent system for high-performance thin-layer chromatography and hagh-performance liquidchromatography of gangliosides(神经节苷脂的高效薄层层析和高效液相层析).《色层学杂志》(J.Chromacogr.)，Amsterdam，v.405，p.125-134，1987。3-GAZZOTI，G.，SONNINO，S.，GHIDONI，R.Normal-phase high-performance liquid chromatography separation of non-derivatizedganglioside mixtures(非衍生的神经节苷脂的正常相位高效液相层析分离).《色层学杂志》(J.Chromatogr.)，Amsterdam，v.348，p.371-378，19854-PREVITI，M.，DOTTA，M，PONT1ERI，G.M.，DiMAR1O，U.，LENTI，L.，Determination of gangliosides by high-performance liquidchromatography with photodiode-array-detection(通过光电二极管矩阵检测的高效液相层析测定神经节苷脂).《色层学杂志》(J Chromatogr.)，Amsterdam，v.605，p.221-225，1992。可以证实上表中显示的技术中的分析时间的差异在20分钟到1小时20分钟内变化。上述方法的保留时间大约为8分钟。此外，可以从文献公开的新方法看见，下文中本专利技术提供的无梯度展开方法，即利用单一流动相(单一组合物)，具有相应的技术优势。活性炭是一种医疗实践，特别是毒理学领域人们经常使用的吸附剂。在其效率中pH是一个重要因素，这加强了证实络合物对pH值的反应和寻找GM1吸附中具有最大效率的条件的重要性。尽管通过利用活性炭可以引导预防药理学试剂和毒素的选择，但是其解毒活性的主要的限制在于对阳离子，例如亚铁离子的吸附无效。包含铁的制剂的偶然的摄取是常见的，这在儿科学中是严重的问题。按照ENGLE等的研究，每年报到大约2,000例铁离子中毒的儿童，因此铁摄取在小儿科是最常见的摄取问题。按照上述文献，尽管频繁发生铁中毒，但还没有普遍接受的方案用于摄取中毒量铁的患者。在这方面，通过建议方法得到的络合物的解毒潜能，如通过体外试验证明的，是可以被选择用于亚铁离子中毒的重要的原因。专利技术概要本专利技术的目的是提供用于制备活性炭GM1络合物的新方法，该方法的特征包含下列步骤(a)制备由0到0.9％氯化钠，0到0.03％磷酸二本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备活性炭－ＧＭ１络合物的方法，其特征为包括下列步骤： （ａ）制备由０到０．９００％氯化钠，０到０．０３０％磷酸二氢钠－２Ｈ↓［２］Ｏ，和０到０．４００％磷酸氢二钠－１２Ｈ↓［２］Ｏ，溶于蒸馏水，组成的稀释溶液（Ａ）； （ｂ）将ＧＭ１溶解于一部分溶液（Ａ）中，使浓度为０．２００到４．０００％，得到新溶液（Ｂ）； （ｃ）将活性炭悬浮在另一部分溶液（Ａ）中，比率为１∶３到１∶７ｗ／ｖ，开始并且维持５到１５分钟的适度的搅动； （ｄ）在搅动下，慢慢地加入足够量的溶液（Ｂ），使比例范围为１∶１００和１∶１０（ＧＭ１∶活性炭），维持搅动１０到２０分钟； （ｅ）过滤该悬浮液，用溶液（Ａ）洗涤该络合物并且干燥；以及， （ｆ）使干燥的络合物通过４０“目”筛，在密封的容器中存储该产品。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：PGD奥利维拉，S斯特皮迪斯，
申请(专利权)人：TRB药物化学和制药工业有限公司，
类型：发明
国别省市：BR[巴西]